Der Enzym produzierende Pilz Trichoderma reesei ist ein idealer Kandidat für die Verzuckerung von pflanzlicher lignozellulosischer Biomasse zu löslichen Zuckern, die zu Bioethanol oder anderen Bioraffinerie Produkten umgewandelt werden können. Für die Produktion von Lignozellulose abbauenden Enzymen sind regulierbare Expressionssysteme notwendig, die weder das Pilzwachstum noch die Enzymproduktion beeinflussen. Pantothensäure ist ein dafür geeigneter Induktor, der die Expression von einigen in einem Cluster angeordneten Genen in T. reesei auslöst. Die Gene dieses Clusters kodieren für eine Pantothenat Permease, einen Zn(II)2Cys6 Transkriptionsfaktor und vier Enzyme, die vermutlich in den Katabolismus von Pantothenat involviert sind. Die ersten beiden Enzyme des Stoffwechselweges, die Pantothenase (PAN1)und die Pantoat 4-Dehydrogenase (PAN2) wurden in Escherichia coli unter Verwendung des pET21a(+) Expressionssystems überexprimiert. Es wurden Enzymassays für diese beiden Enzyme entwickelt und die rekombinant produzierten Enzyme teilweise charakterisiert. Analysen der Gendeletionsstämme des Pantothensäurestoffwechsels zeigten, dass eine Deletion des pan1 Gens zu einem höheren und stabileren Transkriptionslevel der anderen induzierbaren Gene des Clusters führt, was mit einer höheren Konzentration von Pantothenat in diesen Stämmen einhergeht. Zusammengefasst erbringt diese Arbeit einen biochemischen Beweis dafür, dass die Gene des Clusters für Enzyme kodieren, die in den Pantothensäureabbau involviert sind und die Manipulation des Abbauweges dazu benutzt werden kann, um den Transkriptlevel in dem Pantothensäure induzierbaren Expressionssystem zu erhöhen.
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The fungal enzyme producer Trichoderma reesei is an ideal candidate for the saccharification of lignocellulosic plant biomass to soluble sugars, which can be converted to e.g. bioethanol or other biorefinery products. For the production of lignocellulolytic enzymes tuneable promoter systems are needed which do not influence fungal growth and enzyme production. Pantothenic acid is such a candidate inducer that triggers expression of several clustered genes in T. reesei. The genes of this cluster encode a putative pantothenate permease, a fungal Zn(II)2Cys6 transcription factor and four enzymes putatively involved in the catabolism of pantothenate. The first two enzymes of the pathway, the pantothenase (PAN1) and the pantoate 4-dehydrogenase (PAN2) were overexpressed in Escherichia coli using the pET21a(+) expression system. Assays were developed for the two enzymes and the enzymes partially characterized. Km of . Analysis of gene deletion strains in the pantothenic acid pathway showed that deletion of pan1 leads to higher and more stable transcript level of the other pantothenic acid cluster genes putatively due to a higher level of pantothenate in these strains. In summary these results provide biochemical evidence that the genes present in the pantothenic acid inducible gene cluster encode enzymes involved in the pantothenic acid degradation and that their manipulation can be used to enhance the transcript levels in the pantothenic inducible expression system.
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