New approaches in vibrational spectroscopy for particle sensing at the micro-and nanoscale

Abstract

Diese Arbeit beinhaltet die Anwendung der Schwingungsspektroskopie zur off-line und in-line Analyse von Partikelsystemen (P. chrysogenum Sporen, Stärke Partikel, PMMA Partikel, liposomale Nanocarrier) im Mikround Nanomaßstab. Off-line Raman Mikrospektroskopie wurde in Kombination mit einer PLS-DA verwendet, um eine Klassifizierung zwischen lebenden und toten P. chrysogenum Sporen ( 1-3 m im Durchmesser) zu erzielen. Informationen bezüglich der Lebensfähigkeit von Organismen, die in der pharmazeutischen Industrie zur Produktion von Wirkstoffen eingesetzt werden, ist wichtig im Bezug auf optimale Prozessführung, um bessere Fermenter-Auslastungen und höhere Produkterträge zu erreichen. Während die Klassifizierung anhand von off-line Raman Spektroskopie erfolgreich gezeigt werden konnte, leidet die in-line Spektroskopie von Partikeln in einer Suspension oft an einer verhältnismäßig geringeren Signalstärke. Durch die Kombination von in-line Raman Sonden und dem Prinzip der Ultraschall Partikelmanipulation kann die Empfindlichkeit von in-line Messungen deutlich verbessert und zusätzlich ein gewisses Maß an Selektivität erreicht werden. Dazu wurden 2 Prototypen mit unterschiedlichen Geometrien als Aufsatz für in-line Raman Sonden entwickelt und anhand von zwei Partikelsystemen (Stärke und PMMA Partikel) mit einem Durchmesser im unteren Mikrometerbereich charakterisiert. Unter Beachtung der Vorgaben der FDA (Food and Drug Administration), um den Einsatz in der (Bio-)Prozessüberwachung zu ermöglichen, wurden die Prototypen aus 1.4404 Edelstahl gefertigt und an die Geometrie an jene eines D25 Ingold-Stutzens adaptiert. Der Aufsatz ermöglicht die Ausbildung eines stehenden Ultraschall-Feldes, in dessen Knotenebenen Partikel aufkonzentriert werden können. Durch die Aufkonzentrierung der Partikel im Fokus des Raman Lasers konnte in der parallelen Anordnung von Raman Laser und Schallwellenausbreitungsrichtung eine 30-fache Erhöhung der Empfindlichkeit gezeigt werden. Sind Raman Laser und Schallwellenausbreitungsrichtung im rechten Winkel zueinander angeordnet, so gewinnt man zusätzlich Selektivität für die in-line Messungen. Je nach Frequenz des Ultraschalls kann selektiv die flüssige oder feste Phase (Partikel) in den Fokus des Raman Lasers gebracht werden, was die separate Untersuchung von beiden Phasen in gerührten Suspensionen ermöglicht. Darüber hinaus wurden im Rahmen dieser Arbeit Partikel im sub-Mikrometerbereich (Liposome mit einem Durchmesser von 100 nm) anhand der Schwingungsspektroskopie untersucht. Liposome werden zum Transport von hoch toxischen oder reaktiven Wirkstoffen verwendet. Diese werden von der Lipid-Doppelschicht eingeschlossen, wobei das Liposom eine schützende Hülle um den Wirkstoff bildet und somit für einen sicheren Transport z. B zum Tumor, wo der Wirkstoff freigesetzt werden soll, sorgt. Die Variabilität bei der Herstellung dieser Transportvesikel führt allerdings zu unterschiedlichen Verkapselungseffizienzen (= Menge an Wirkstoff, die tatsächlich im einzelnen Liposom verkapselt ist). Daher ist die Untersuchung der Verkapselungseffizienz in einzelnen Nanocarriern besonders wichtig im Bezug auf Arzneimittelzulassung, um die Menge des tatsächlich verabreichten Wirkstoffes zu bestimmen. Unterschiedliche experimentelle Ansätze basierend auf IR und Raman Spektroskopie, zwei optische Methoden, deren laterale Auflösung durch das Beugungslimit begrenzt ist, werden in dieser Arbeit gezeigt. Während konfokale Raman und SNOM-SERS Spektroskopie wenig erfolgversprechende Ergebnisse lieferten, erlaubt die Kombination von IR Spektroskopie und Rasterkraftmikroskopie (AFM-IR) die Detektion von chemischer Information mit einer lateralen Auflösung von 20 nm. Bei Verwendung der Resonanz-verstärkten AFM-IR Spektroskopie im Kontakt-Mode sind aufgrund der mechanischen Eigenschaften der Probe (weich, mechanisch nachgebend) einige Probleme zu berücksichtigen wie beispielsweise die geringe Kraftübertragung von der Probe auf die Spitze des AFM Cantilevers oder hohe Scherkräfte, die auf die Probe wirken. Bessere Ergebnisse konnten anhand der AFM-IR Spektroskopie im Tapping-Mode erzielt werden. Dabei wird das Messsignal durch eine heterodyne Detektion ausgelesen, was den qualitativen Nachweis des chemotherapeutischen Wirkstoffs in einzelnen Liposomen basierend auf der spezifischen Absorption im mittleren Infrarot-Bereich ermöglichte. Dabei konnten eine laterale Auflösung von 10 nm und eine Empfindlichkeit, die die Wirkstoff-Detektion im Zeptomol-Bereich erlaubt, gezeigt werden.

In this thesis, vibrational spectroscopy is employed for in-line and off-line analysis of particle systems (P. chrysogenum spores, starch particles, PMMA particles, liposomal nanocarriers) at the microand nanoscale. Off-line Raman micor-spectroscopy in combination with PLS-DA was used to develop a classifier that differentiates P. chrysogenum spores ( 1-3 m in diameter) based on their viability. Knowledge on the viability of organisms used in the pharmaceutical industry is directly linked to optimized process control, better work-loads and higher yields. However, while the classification of living and dead spores based on off-line Raman spectroscopy was demonstrated, the Raman signal of particles in a suspension detected by in-line probes usually suffers from low signal sensitivity. Leveraging ultrasonic particle manipulation in combination with in-line probes, two prototypes with different geometries were designed as add-on for Raman in-line probes and characterized with particles in the lower m-range (starch and PMMA) to allow in-line measurements with increased sensitivity and selectivity. Two custom-made prototypes fabricated out of 1.4404 stainless-steel were designed to fit a D25 Ingold port and ensuring FDA-compatibility to enable applications in (bio-)process monitoring. These add-ons allow to build-up an acoustic resonator in front of the Raman probe resulting in the formation of an ultrasonic quasi-standing wave field that enables accumulation of particles in the nodal planes. An increase in sensitivity of 30 was demonstrated by accumulating particles in the focus of the Raman laser (parallel arrangement of Raman laser and acoustic wave propagation). Furthermore, the perpendicular arrangement of ultrasonic wave and laser propagation allows to add selectivity to Raman in-line sensing; depending on the ultrasonic frequency, either the liquid or solid phase can be moved in the laser focus allowing selective investigation of both components of stirred suspensions. Furthermore, this thesis reports on the research efforts made for the characterization of even smaller particles: liposomes with a diameter of 100 nm. Liposomes are used as drug delivery systems, especially for highly toxic or reactive substances where the lipid bilayer forms a protective shell around the encapsulated cargo. However, variabilities in liposome preparation necessitate the investigation of encapsulation efficiency in individual nanocarriers to ensure drug approval and efficacy. Experimental results based on IR and Raman spectroscopy which are both optical-based methods and, hence, diffraction-limited in the achievable spatial resolution, are illustrated. Confocal Raman and SNOM-SERS spectroscopy are shown having minor success for the investigation of such small samples. Therefore, AFM-IR, the combination of atomic force microscopy (AFM) and IR spectroscopy which allows to detect chemical-specific information but with a lateral resolution 20 nm, was employed for final investigation. For contact mode resonant AFM-IR spectroscopy, several challenges were faced, such as low sample-tip force, high mechanical shear force which is exerted onto the sample, and careful selection of the contact resonance frequency tracking range. Leveraging the novel tapping mode AFM-IR method based on heterodyne detection, detection of the chemotherapeutic drug in individual liposomes based on its characteristic mid-IR fingerprint was demonstrated with impressive sensitivity (zeptomol range) and lateral resolution ( 10 nm).