Optimierung der PCR für Microarray-basierte Pathogendetektion

Abstract

Das von Kostic et al. entwickelte mikrobielle diagnostische Mikroarray ermöglicht die spezifische Detektion von Pathogenen in Lebensmitteln und Wasser mit Hilfe des phylogenetisch robusten gyrB Gens als diagnostischen Marker. Das System ist allerdings nicht sensitiv genug, wobei die Amplifikation des gyrB Gens der limitierende Faktor ist. Im Rahmen dieser Arbeit, sollte daher die gyrB PCR optimiert werden. Die folgenden Ansätze wurden dafür verwendet: i) nested PCR mit Primern komplementär zum sequencing tag der ursprünglichen, degenerierten Primer, die 1995 von Yamamoto und Harayama publiziert wurden, und ii) Design neuer Primer. Die nested PCR lieferte keine reproduzierbaren Ergebnisse, daher wurden neue Primer spezifisch für die folgenden Spezies designed: Salmonella spp., E. coli, Y. enterocolitica, Y. pseudotuberculosis, S. aureus, C.<br />jejuni, C. lari, C. coli, C. upsaliensis, C. perfringens and C.<br />difficile. Die Primer wurden individuell und als Primermix mit gDNA der einzelnen Stämme sowie mit gDNA-Mischungen getestet. Der Primermix mit einer Primerkonzentration von je 150nM lieferte die besten Ergebnisse, wobei die Nachweisgrenze von S. Typhimurium um mindestens zwei Log-Stufen niedriger war. Experimente mit einer gDNA-Mischung von vier verschiedenen Organismen haben gezeigt, dass nach Amplifikation mit den neuen Primern alle bei einer Konzentration von 50ng/µl nachgewiesen werden konnten, während nur zwei Organismen nach Amplifikation mit den alten Primern detektiert wurden. Außerdem wurden Experimente mit gespickten Lebensmittelproben durchgeführt, die die Anwendbarkeit der Primer für die Lebensmittelanalyse bestätigten.

The microbial diagnostic microarray (MDM) that was developed by Kostic et al. (2007, 2010) allows the highly specific detection of food- and water-borne pathogens using the phylogenetically robust gyrB gene as diagnostic marker. However, the system lacks sensitivity; the amplification of the gyrB gene being the limiting factor. Thus, the gyrB PCR should be optimized in the course of this project. Different approaches were tried in order to do so: i) a nested PCR targeting the sequencing tags of the original, highly degenerate gyrB primers that were published by Yamamoto and Harayama (1995) and ii) new primers were designed. The nested approach failed to yield reproducible results in the initial experiments and had to be discontinued. Therefore, new species-specific primers were designed for the set of selected species (Salmonella spp., E. coli, Y. enterocolitica, Y. pseudotuberculosis, S. aureus, C. jejuni, C. lari, C. coli, C. upsaliensis, C. perfringens and C. difficile) and tested individually and as primer mix using both single strain gDNA and gDNA mixes. It was found that a primer mix with a concentration of 150nM each performed best, improving the limit of detection (LOD) of the MDM by at least two log steps for S. Typhimurium. Tests with a mix containing gDNA from four different organisms showed that all of them could be detected at concentration of 50ng/µl when amplified with the new primers, while only two could be detected after amplification with the old primers. Furthermore, experiments with spiked food samples were conducted, showing that the new primers are suitable for the application in food analysis.<br />