Development of microvascular networks from outgrowth endothelial cells cocultured with adipogenically and osteogenically differentiated and undifferentiated adipose-derived stem cells in fibrin

Abstract

In dieser Studie wurden mikrovaskuläre Gefäßnetze durch Kokultur primärer, ausdifferenzierter Endothelzellen (OECs), isoliert aus menschlichem, peripherem Blut, auf CytodexTM 1 Zellulosekügelchen mit entweder undifferenzierten, osteogen oder adipogen differenzierten, aus Fettgewebe gewonnenen Stammzellen (ASCs) in Fibrin generiert. OEC Monokultur in Fibrin diente als Negativkontrolle. Die Netzwerke wurden anhand von drei verschiedenen Parametern charakterisiert, nämlich dem Prozentanteil von Kügelchen, von welchen Gefäße sprießen, die Anzahl der Sprosse pro Kügelchen und die mittlere Länge der Sprosse. Der Gebrauch differenzierter ASCs wurde kritisch überdacht, nachdem sich herausstellte, dass sie zu weiterer Differenzierung in dieselbe, aber auch die andere Nische differenzieren können. Von dieser Beobachtung ausgehend wurde rückgeschlossen, dass nur undifferenzierte ASCs in Fibrin transferiert wurden, während intakte, differenzierte ASCs entweder nicht von der Zellkulturplatte abgelöst werden konnten, oder sie dem mechanischen Stress beim Herunterlösen und der Zentrifugation ausgesetzt waren, nicht überlebten. Darum wurden weitere Untersuchungen auf die Kokultur mit undifferenzierten ASCs beschränkt. Unter anderem wurde die Qualität der vaskulären Netzwerke mit und ohne CytodexTM 1 Zellulosekügelchen wie auch verschiedene OEC/ASC Kokulturverhältnisse, nämlich 1:1, 2:1, 5:1 und 20:1 evaluiert. Während die Fibrin-Clots ohne Kügelchen ungefähr 106 OECs/ml enthielten, wurden ca. 105 OECs/ml auf Kügelchen in die Clots transferiert. Um dieselbe Zelldichte zu erreichen, müssten zehn Mal mehr Kügelchen dem Fibrin zugegeben werden. Das würde allerdings einen großen Verlust an Raum im Fibrin mit sich bringen, welcher aber für die Bildung von Gefäßen genutzt werden muss. Hinsichtlich der verschiedenen Zellzahlen, das Kokultur-Verhältnis 5:1 resultierte in mehr und besser verzweigten Gefäßen verglichen mit 1:1 und 2:1. Die Anzahl von Gefäßen bei einem Verhältnis von 20:1 war vergleichbar mit der von 5:1, obwohl die Zahl der OECs vierfach höher war. Aufgrund dieser Betrachtungen wurde beschlossen, dass die Kokultur von OECs ohne Kügelchen mit ASCs im Verhältnis 5:1 die günstigste Variante unter den untersuchten war. Letztendlich wurde der Ansatz makroskopische, vaskuläre Gefäßnetze aus dezellularisiertem Gewebe zu bilden, aufgegriffen. Ein Stück Plazentagewebe wurde dezellularisiert, indem verschiedene Detergenzien für 13 Tage bei 4°C durch die Gefäße gepumpt wurden. An den Tagen 8 und 11 wurden die Gefäße mit einer enzymatischen Verdauungslösung für 24 Stunden bei 37°C gespült. Um festzustellen, ob die Gefäße danach noch immer mit Zellen ausgekleidet waren, wurde eine Hämatoxylin- und Eosinfärbung von zwei Mikrotom-geschnittenen, in Paraffin gegossenen Querschnitten durchgeführt. Der erste stammte von einem behandelten Gefäß und der zweite von einem nicht-dezellularisiertem Gefäß desselben Plazentastückes. Im ersten waren keine Zellkerne mehr präsent, während der zweite Querschnitt eine durchgehende Beschichtung mit Zellen aufwies. Aufgrund dieses Resultats wurde die Dezellularisierung als erfolgreich angesehen. Da die Zeit am Ende dieser Studie schon sehr limitiert war, wurde keine Neubesiedelung des dezellularisierten Plazentagewebes mehr durchgeführt. Im Allgemeinen kann man zu dem Schluss kommen, dass sowohl OECs als auch ASCs anhand einer minimal invasiven Biopsie von erwachsenen Patienten gewonnen werden können. Deshalb kann autogenetisches, prä-vaskularisiertes Gewebe in vitro regeneriert werden und in der Klinik für die Behandlung von z.B. Herzinfarkt oder das Ischämiesyndrom verwendet werden [Schächinger et al. 2004, Kawamura et al. 2005].<br />

In this study microvascular networks were generated by coculture of primary outgrowth endothelial cells, isolated from human peripheral blood, on CytodexTM 1 cellulose beads together with either undifferentiated, osteogenically or adipogenically differentiated adipose-derived stem cells in fibrin. OECs in monoculture in fibrin served as negative controls. The networks were characterized via three different parameters, namely the percentage of beads with sprouts, the number of sprouts per bead and the average length of the sprouts. The use of differentiated ASCs was critically reconsidered after it was found that they were capable of further differentiation into the same and also another lineage in monolayer culture. From this observation, it was deduced, that only undifferentiated ASCs were transferred into fibrin, while intact, differentiated ones could either not be detached from the cell culture plate or did not survive due to the mechanical stress, which they were encountered to during detachment and centrifugation. Therefore, further investigations were focused on the coculture with undifferentiated ASCs which included the comparison of the generated networks with and without CytodexTM 1 cellulose beads as well as different OEC/ASC coculture ratios. While approximately 106 OECs/ml were added into fibrin clots without beads, only 105 OECs/ml were present in fibrin clots, when they were previously seeded onto beads. To achieve the same cell density, 10 times more beads would have to be added into fibrin, which would have implicated a great loss of space in fibrin that could otherwise be used for tubule formation. Regarding the differences between the different coculture ratios, it was found, that 5:1 resulted in more and higher anastomosed tubules compared to 1:1 and 2:1. The number of tubules at a ratio of 20:1 was comparable to that at 5:1, though the number of OECs was four fold higher. Based on these considerations, it was concluded, that the coculture of OECs without beads together with ASCs at a ratio of 5:1 was the most favorable condition among the investigated ones. Finally the approach of generating a macroscopic vascular network by use of a decellularized tissue was picked up. Two vessels of a piece of placental tissue were treated by pumping different detergents through for thirteen days at 4°C. On the days 8 and 11, the vessels were rinsed with an enzymatic digestion solution for 24 hours at 37°C. To determine, whether cells were still lining the vessels, haematoxylin and eosin staining was performed on two microtome-cut, in paraffin casted cross sections. In the first one, originating from the treated vessel, no cell nuclei were present any more. The second one was from a non-treated vessel of the same placental tissue piece and showed a continuous lining of cells on its wall. Due to this result, the decellularization was considered successful. Due to limitations in time for this thesis, the cell behavior in the decellularized tissue was not investigated any more.<br />Generally, it can be concluded, that both cell types, OECs and ASCs can be obtained from adult patients by minimally invasive biopsy. Thus, autologous pre-vascularized tissue can be regenerated in vitro and used for clinical treatment of e.g. myocardial infarction or critical limb ischemia [Schächinger et al. 2004, Kawamura et al. 2005].