Molecular physiology of reductive monosaccharide catabolism by Hypocrea jecorina

Abstract

Im Gegensatz zu den umfassenden Kenntnissen über die komplexen Enzymsyssteme, die zum hydrolytischen Abbau der Hemizellulosen zu deren monomeren Bausteinen führen, weiß man heute noch immer wenig über den weiteren Katabolismus jener Monomere und inwiefern diese die jeweilige Hemizellulaseproduktion regulieren. Diese Arbeit befasst sich mit einigen im Pentosekatabolismus involvierten Enzymen eines industriellen Zellulase- und Hemizellulaseproduzenten, Hypocrea jecorina, ein filamentöser Pilz, der seit geraumer Zeit von industrieller Bedeutung ist. Die D-Xylosereduktase katalysiert den Anfangsschritt sowohl im D-Xylose- als auch im L-Arabinose-Abbauweg, vier weitere Gene, die für ebensolche Enzyme kodieren, konnten in der durchsequenzierten Gendatenbank von H.<br />jecorina identifiziert werden. Die Eigenschaften des rekombinanten Proteins sowie zellfreie Extrakte des Pilzes demonstrierten neben der enzymatischen Aktivität mit D-Xylose und L-Arabinose auch eine signifikante Reaktion mit D-Galaktose. Diese reduktive Umwandlung stellt nicht nur den Anfangsschritt eines parallel zum Leloir-Abbauweg operierenden katabolen Weges dar, sondern ist auch essentiell zur maximalen Induktion der Zellulaseproduktion durch Laktose.<br />Die darauffolgende Umwandlung im Pentosekatabolismus wird durch zwei verwandte Enzyme (sog. Alkoholdehydrogenasen) katalysiert, die sich während der Evolution als zwei getrennte Gruppen zu unterschiedlichen Zeitpunkten aus den Sorbitoldehydrogenasen entwickelten. Beide Enzyme zeigen fast das gleiche Substratspektrum, wobei unterschiedliche Substrataffinitäten von physiologischer Relevanz sind.<br />Interessanterweise spielen diese Enzyme auch im neuartigen reduktiven D-Galaktose-Abbauweg wichtige Rollen. Eines der beiden als Katalysator der Umwandlung von Galactitol zu L-Xylo-3-hexulose und das andere oxidiert D-Sorbitol zu D-Fruktose. Diese beiden genau untersuchten Dehydrogenasen lassen auf ein, den Pilzen eigenen Phänomen schließen:<br />Ein Enzym kann das Fehlen des Anderen zumindest zum Teil kompensieren indem es dessen Umwandlungsreaktion katalysiert, jedoch meist mit geringerer Aktivität.<br />Zuletzt ergab die Untersuchung eines "Verbindungsenzyms", das durch die Umwandlung von L-Xylulose zu Xylitol, die beiden Pentose-Abbauwege, nämlich den der L-Arabinose und der D-Xylose miteinander verknüpft.<br />Auch für diesen katalytischen Schritt gibt es mehrer Enzyme und eine weitere Biokonversion, die Reduktion von L-Sorbose zu D-Sorbitol wird von diesem Enzym katalysiert, was seine Rolle im reduzierenden D-Galactose-Abbauweg beweist.<br />

Despite the comprehensive knowledge on the enzyme systems degrading hemicelluloses to their monomers, little is however known about the further metabolism of the hemicellulose monomers in filamentous fungi, and how this metabolism regulates the synthesis of the respective hemicellulases.<br />This work was concerned with several enzymes of Hypocrea jecorina (anamorph Trichoderma reesei) involved in L-arabinose and D-xylose catabolism. The initial reductive step of these two pentose pathways was shown to be catalyzed by D-xylose reductase. The enzyme does not account for all pentose reductase activity indicating the presence of additional genes encoding for enzymes with similar function. This suggestion was confirmed by the finding of four putative genes encoding aldose or D-xylose related reductases in the genome of this fungus.<br />Characteristics of the recombinant protein and of cell free extracts showed significant activity of this enzyme with D-galactose, which was presumed to initialize an additional catabolism for this aldose, which is essential for full induction of the main cellulases of H. jecorina by lactose, a feasible industrial application. For catalysis of the following step of pentose catabolism two related enzymes were identified, which evolved as separate branches from the evolutionary line leading to mammalian D-sorbitol dehydrogenases. Both enzymes display largely the same substrate specificity, but their differences in substrate affinity are physiologically relevant.<br />Interestingly these enzymes are also involved in a novel reductive D-galactose pathway, one catalyzing the second step, the conversion of galactitol to L-xylo-3-hexulose and the other one mainly converting D-sorbitol to D-fructose. Investigation of the metabolic role of these two dehydrogenases suggested a common phenomenon in fungi - the partially compensation of functional loss of one enzyme by the other one. Finally the in vivo performance of the linkage enzyme, which connects the L-arabinose and D-xylose metabolism by converting L-xylulose to xylitol demonstrated also the presence of further enzyme(s) with similar characteristics. Besides this key bioconversion, the enzyme catalyzes the reduction L-sorbose to D-sorbitol in vivo thereby demonstrating its role in the reductive D-galactose pathway.