Diazirine-FAD : a stable cofactor for biocatalysts and a molecular probe

Abstract

Flavinabhängige Enzyme repräsentieren eine außergewöhnliche Klasse an Biokatalysatoren, die für zahlreiche industrielle Anwendungen von großem Interesse sind, aber auch für alle Tiere, Pflanzen und Mikroorganismen eine besondere Bedeutung zukommt. In der Regel ist der Flavin-Kofaktor nicht kovalent an die Proteinstruktur gebunden. Hieraus resultiert der große Nachteil von Flavoenzymen, da durch die nicht-kovalente Anbindung der Kofaktor aus dem Proteinmolekül dissoziieren kann, wodurch es zu einer raschen Inaktivierung und Denaturierung des Enzyms kommt. Folglich ist die Anwendung von Flavoenzymen in der Biokatalyse für die Herstellung von medizinischen Wirkstoffen oder als Bestandteil in Biosensoren stark eingeschränkt. In diesem Projekt konzentrierten wir uns auf die Entwicklung einer neuen Methodik zur Stabilisierung von flavinabhängigen Enzymen durch die kovalente Anbindung des FAD-Kofaktors an verschiedene für Biosensoren und Bioprozesse wichtige Enzyme. Inspiriert von der Methode der Photoaffinitätsmarkierung hatten wir das Ziel, die Ausbildung der kovalenten Anbindung nur durch Licht zu initiieren, wodurch die korrekte Einbettung und Anbindung des Kofaktors auf eine nicht invasive Art ermöglicht wird.Um die photoinduzierte Anbindung zu realisieren, entwarfen und synthetisierten wir sechs FAD-Analoga mit der photolabilen Diazirine-Gruppe. In weiterer Folge entwickelten wir für die drei Modellenzyme Glucose-Oxidase (Aspergillus niger), Cellobiose-Dehydrogenase (Pichia pastoris) und Cyclohexanon-Monooxygenase (Acinetobacter calcoaceticus NCIMB9871) Methoden zur Deflavinierung und deren effizienten Rekonstitution mit den synthetisierten FAD-Derivaten. Die richtige Einbettung der FAD-Analoga wurde durch Messung der spezifischen Aktivitäten des jeweiligen Enzyms untersucht und die lichtinduzierte kovalente Anknüpfung konnte durch Fluoreszenzmessungen von SDS-PAGE Gelen sowie massenspektrometrischen Analysen experimentell bestätigt werden.Von allen untersuchten Enzymen konnte die Aktivität durch die Rekonstitution mit den synthetischen FAD-Derivaten wiederhergestellt werden. Die besten spezifischen Aktivitäten waren vergleichbar mit den Ergebnissen von Kontrollexperimenten, die mit nativem FAD-Kofaktor durchgeführt worden sind. Abschließend wurde der stabilisierende Effekt der kovalenten Anbindung durch Messung der thermischen und kinetischen Stabilität untersucht. Die lichtinduzierte Anknüpfung des Kofaktors FAD an Flavoenzymen verhindert dessen Dissoziation und stellt eine neuartige Methode zur Stabilisierung von Flavoproteinen dar, wodurch deren Einsatz in der Biokatalyse und in Biosensoren verbessert werden kann.

Flavin-dependent enzymes represent an extraordinary class of biocatalysts that is important to industry and life. However, although the flavin cofactors empower their tremendous transformations, their cofactor dependency is a limitation. Typically, the cofactors are non-covalently bound to the enzymes, and their dissociation results in the loss of the enzymes' activities and stabilities. This drawback of flavoenzymes compromises their applicability in biosensing and biocatalysis. In this project, we aimed to develop a general approach for improving the stability of flavoenzymes by covalently binding the cofactor FAD to proteins of interest to impede the cofactor's dissociation. Based on the photoaffinity labeling technique, covalent anchoring of the cofactor should occur only using a light stimulus, which allows tethering at will and thus enables the correct incorporation of the cofactor. Therefore, we designed and synthesized a set of six FAD analogs bearing a diazirine moiety to allow the photoinduced covalent attachment. Different flavoenzymes, including glucose oxidase (Aspergillus niger), glucose dehydrogenase (Pichia pastoris), and cyclohexanone monooxygenase (Acinetobacter calcoaceticus NCIMB9871), were selected as model enzymes, and suitable protocols for the preparation of apoenzymes and their efficient reconstitution with synthesized FAD analogs were established. The proper incorporation of FAD analogs was studied by specific activity assays, and the light-induced covalent anchoring was confirmed by in-gel fluorescence and mass analysis. With all enzymes investigated, the activity could be restored by the reconstitution with synthetic FAD analogs, and the best specific activities were similar to the results of control experiments performed with native FAD. Ultimately, the stabilizing effect of the covalent modification was assessed by measuring the thermal and kinetic stability. The light-induced covalent tethering of the FAD analogs prevents enzyme inactivation by cofactor loss and is considered a unique and novel approach for stabilizing flavoenzymes and enhancing their applicability in biocatalysis and biosensing.