Investigation of different bioprocess modes with Escherichia coli

Abstract

Escherichia coli ist einer der am häufigsten verwendeten Mikroorganismen in der Biotechnologie. Obwohl der Mikroorganismus eine geringe Komplexität hat und die Produktion von Antikörpern oder Proteinen mit post-translationalen Modifikationen kaum möglich ist, sind Eigenschaften wie schnelle Wachstumsraten, kostengünstige Medien und eine Vielzahl an Möglichkeiten den Organismus genetisch zu verändern, Gründe für die zahlreichen Anwendungen. Die Produktion heterologer Proteine wird derzeit vor allem in Fed-Batch Kultivierungen durchgeführt, da hier in kurzer Zeit hohe Produktkonzentrationen erreicht werden können. Allerdings ist das Fed-Batch Verfahren derzeit mit großen Anlagen verbunden, die zu erhöhten Energiekosten sowie hohen CO2-Emissionen und einem hohen Wasserverbrauch führen. Es ist daher wirtschaftlich und umwelttechnisch wünschenswert den Produktionsstillstand zu verringern. Dies kann durch repetitive Fed-Batch oder kontinuierliche Kultivierungen erreicht werden. Darüber hinaus würde eine Umstellung auf eine kontinuierliche Produktion Vorteile beim Scale-up, der Reaktorgröße und dem Anlagenbau bringen, was den CO2-Ausstoß verringern würde. Außerdem kann durch eine kontinuierliche Ernte des Produkts und längere Kultivierungszeiten der Produktionsstillstand reduziert werden, wodurch die volumetrischen Ausbeuten erhöht werden. Allerdings sind kontinuierliche Anwendungen für die rekombinante Proteinproduktion mit E. coli derzeit aufgrund von abnehmenden Produktivitäten und Instabilitäten bei Langzeitkultivierungen weit hinter jenen von anderen Industriezweigen zurück. In meiner Dissertation untersuchte ich i) verschiedene E. coli-Expressionssysteme, ii) eine Vielzahl von Prozessparametern und iii) verschiedene Substrate in Fed-Batch, repetitiven Fed-Batch und kontinuierlichen Kultivierungen mit E. coli, um Informationen über die Prozesse zu sammeln, Probleme und Hürden zu identifizieren und die Prozessausbeute zu steigern. Dabei habe ich festgestellt, dass die räumliche Trennung von Biomassewachstum und rekombinanter Proteinexpression in kaskadierten kontinuierlichen Kultivierungen vielversprechend ist, um eine stabile Produktbildung mit E. coli in Langzeitkultivierungen zu erreichen. Daher wurde ein Arbeitsablauf zur Umsetzung kaskadierter kontinuierlicher Kultivierungen entwickelt, wodurch die Raum-Zeit-Ausbeuten im Vergleich zu Fed-Batch Kultivierungen verbessert wurden. Meine Dissertation beleuchtet verschiedene Bioprozessmodi, durchgeführt mit dem wichtigen Expressionswirt E. coli, mit dem Ziel Prozesswissen zu generieren, um die etablierte Fed-Batch Kultivierung in einen kontinuierlichen Prozess umzuwandeln.

Escherichia coli is one of the most used microorganisms in biotechnology. Even though the complexity of this microorganism is low and the production of antibodies or proteins with post-translational modifications is hardly possible, traits, like fast growth rates, inexpensive media, and an almost limitless genetic toolbox, emphasize its widespread utilization. To date, the production of heterologous proteins is primarily carried out in fed-batch cultivations due to high achievable product concentrations within a short time. However, state-of-the-art fed-batch processing is accompanied by large equipment sizes causing increased energy costs as well as high CO2 emissions and water consumption. The reduction of downtimes is economically and environmentally desirable and could be achieved with repetitive fed-batch or continuous cultivations. Furthermore, a switch towards continuous manufacturing would bring benefits in scale-up, reactor size and facility design, leading to a lower carbon footprint. Due to a continuous harvest of product and longer cultivation times, the downtimes are reduced, resulting in higher yields. However, continuous applications for recombinant protein production with E. coli tremendously lack behind other industrial sectors, due to decreasing productivities and instabilities in long-term cultivations. In my Thesis I investigated i) different E. coli expression systems, ii) a variety of process parameters, and iii) different substrates in fed-batch, repetitive fed-batch and continuous cultivations with E. coli to generate process knowledge, identify bottlenecks and increase the bioprocess performance. I found that the spatial separation of biomass growth and recombinant protein expression in cascaded continuous cultivations is promising to achieve stable product formation with E. coli in long-term cultivations. I proposed a workflow to implement cascaded continuous cultivations, leading to improved space-time yields compared to typical fed-batch cultivations. In summary, my Thesis sheds light onto different bioprocess modes with the highly important expression host E. coli aiming at the generation of process knowledge to transform the typical fed-batch mode to a continuous process.