Title: New chemical and biological insights into the chemistry of highly reactive oxygen species
Language: English
Authors: Freinbichler, Wolfhardt 
Qualification level: Doctoral
Keywords: Fenton Reaktion; Hydroxyl Radikale; Mikrodialyse; Eisen; oxidativer Stress; Terephthalat; Bathophenanthrolin; HPLC; hoch reaktive Sauerstoffverbindungen
Fenton reaction; hydroxyl radicals; microdialysis; oxidative stress; terephthalate; bathophenanthroline; HPLC; highly reactive oxygen species
Advisor: Linert, Wolfgang 
Assisting Advisor: Della Corte, Laura 
Issue Date: 2007
Number of Pages: 113
Qualification level: Doctoral
Abstract: 
Der Schwerpunkt der vorliegenden Arbeit ist einerseits die Entwicklung einer neuen zuverlässigen Methode, um hoch reaktive Sauerstoffverbindungen direkt im Gehirn mittels Mikrodialysesonden messen zu können, und andererseits die chemisch-mechanistische Untersuchung der Fenton Reaktion unter physiologische Bedingungen, da diese höchstwahrscheinlich den Grund für die Bildung dieser Verbindungen im Gehirn darstellt. Des Weiteren werden die Entwicklung und in vivo Anwendung von zwei weiteren Methoden beschrieben, wobei eine zur Bestimmung von reaktivem Eisen (II) sowie freigesetztem Eisen (III) und die andere zur Messung von Wasserstoffperoxid herangezogen werden kann. Hochreaktive Sauerstoffverbindungen (hROS), die im Allgemeinen entweder als Hydroxylradikale oder Eisen(IV) Verbindungen auftreten, wird eine entscheidende Rolle bei der Entstehung von neurodegenerativen Krankheiten und beim Alterungsprozess zugeschrieben. Aufgrund ihrer sehr hohen Reaktivität ist eine direkte Messung derzeit unmöglich, und es muss auf indirekte Methoden, die meist auf der Hydroxylierung von Aromtaten basieren, zurückgegriffen werden. Die am häufigsten benutzte Methode zu ihrer Messung greift auf die Hydroxylierung von Salicylsäure zurück. Da diese jedoch einerseits biologisch aktiv ist, und andererseits ihre, je nach chemischer Umgebung unterschiedlichen, Hydroxylierungsprodukte keine einwandfreie Quantifizierung erlauben, wurden immer wieder andere Substanzen als Alternative vorgeschlagen. In dieser Arbeit wurde die Hydroxylierung von Terephthalsäure (TA), deren Produkt die äußerst gut fluoreszierende 2-Hydroxy-Terephthalsäure (OH-TA) ist, sowohl nach chemischen als auch nach biologischen Kriterien untersucht. Es konnte festgestellt werden, dass TA weder die Neurotransmitter Glutamat, Aspartat, [gamma]-Aminobuttersäure und Taurin im Striatum der Ratte beeinflusst, noch chemische Artefakte einer genauen Quantifizierung von hROS im Wege stehen. Die in vivo Stimulierung des Striatums mit drei unterschiedlichen Konzentrationen des Neurotoxins Kainsäure ergab eine Dosis abhängige Bildung von hROS, womit das Funktionieren der Methode bestätigt werden konnte. Auf der anderen Seite konnte gezeigt werden, dass neuroprotektive Substanzen die hROS Bildung unterdrückten. Von praktischem Vorteil ist weiters, dass OH-TA gemeinsam mit o-Phthaldialdehyd derivatisierten Aminosäuren mittels HPLC gemessen werden kann, und so keine zusätzlichen Probemengen gebraucht werden. Wird die hROS Bildung durch die Fenton Reaktion in einer der extrazellulären Flüssigkeit nachempfundenen Salzlösung beobachtet, so ist die Menge vom gebildeten OH-TA unabhängig von der TA Konzentration.
Diese Beobachtung kann nicht mit der Bildung von freien Hydroxylradikalen in Übereinstimmung gebracht werden, sondern ausschließlich mit einem "krypto" Radikal oder einer Eisen(IV) Verbindung erklärt werden. Diese Annahme konnte mit Experimenten in Kaliumacetetat Puffer mit Hilfe eines durch kinetische Messungen unterstützen Reaktionsschemas bestätigt werden. Um die Fenton Reaktion auch in vivo messen zu können war es notwendig mit kleinsten Probemengen eine Eisen -und Wasserstoffperoxidbestimmung durchführen zu können. Die bereits bekannte, aber für Mikrodialyseexperimente nicht brauchbare, photometrischen Eisenbestimmung mit Hilfe von Bathophenanthrolin wurde modifiziert, um Eisenmengen im nano-molaren Bereich unter Verwendung der nicht selektiven UV-Bande bei 385 nm mittels HPLC messen zu können. Zusätzlich wurde Wasserstoffperoxid mit Hilfe von TA und Fe(II)EDTA bestimmt. Es konnte gezeigt werden, dass die in vivo Stimulierung mit 6-Hydroxy-dopamin, das als einfaches Tiermodell für die Parkinson`sche Krankeit gilt, zu einer massiven Eisen- und Wasserstoffperoxidfreisetzung führt, wobei für die hROS Bildung ausschließlich die Menge an aktivem Eisen (II) entscheidend ist.

The main emphasis of this work was to develop and test a new reliable method to detect in vivo highly reactive oxygen species (hROS) directly in the rat's striatum using microdialysis and to analyse a Fenton system in a chemical environment approximated to the extra cellular fluid utilising kinetic measurements. Beside that, two new methods to detect iron and H2O2 in the nano-molar range with sample volumes of few micro-litres via HPLC are introduced. Finally the results of in vivo experiments using a simple model of Parkinson's disease, combing all methods developed in this work are presented.
Sodium terephthalate was validated as a new robust and sensitive chemical trap for highly reactive oxygen species (hROS), lacking the drawbacks of the salicylic acid method. Reaction of the almost non-fluorescent terephthalate (TA2-) with hydroxyl radicals or ferryl-oxo species resulted in the stoichiometric formation of the brilliant fluorophor 2-hydroxyterephthalate (OH-TA). Neither hydrogen peroxide nor superoxide reacts in this system. This procedure was validated for determining hROS formation during microdialysis under in vivo conditions, accompanied by chemical in vitro investigations.
Derivatisation with o-phthalaldehyde, for amino acid detection, had no effect on OH-TA fluorescence, which could easily be resolved from the amino acid derivatives by HPLC, allowing determination in a single chromatogram, with a detection limit of 0.5 femtomol/µl of OH-TA in microdialysis samples. In microdialysis experiments the neurotoxin kainate was shown to evoke hROS formation in a dose-dependent manner.
The presence of TA2- in the perfusion fluid did not affect basal or evoked release of aspartate, glutamate, taurine and GABA. Assessment of cell death 'ex vivo' showed TA2- to be non-toxic at concentrations up to 1.0*10-3 mol/L . The in vitro results based on kinetical measurements indicate a mechanism in the Fenton system (Fe2+ + H2O2) without the involvement of a free hydroxyl radicals, whereby TA2- forms a primary complex with Fe2+ followed by an intramolecular hydroxylation accompanied by intramolecular electron transfer. To measure all relevant compounds involved in the Fenton reaction also in vivo, two new methods, based on known procedures, to measure iron and H2O2 were developed. Iron was detected by HPLC using the non selective UV band at 285 nm of the Fe(II)-bathophenanthroline complex, whereas H2O2 was measured by utilising Fe(II)EDTA and TA. In the end of this work the in vivo results regarding hROS, active and released iron and H2O2 using the stimulation with 6-hydroxy-dopamine (6-OHDA) which can be considered a simple model of PD, are presented. It is shown that the massive formation of hROS after stimulation is mainly caused by active Fe(II) and not by total iron or H2O2.
URI: https://resolver.obvsg.at/urn:nbn:at:at-ubtuw:1-15308
http://hdl.handle.net/20.500.12708/13990
Library ID: AC05035876
Organisation: E163 - Institut für Angewandte Synthesechemie 
Publication Type: Thesis
Hochschulschrift
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