Title: Recombinant whole-cell mediated baeyer-villiger oxidation from parallel mini-scale screening to fermenter up-scaling for natural product synthesis
Language: English
Authors: Rudroff, Florian 
Qualification level: Doctoral
Advisor: Mihovilovic, Marko D.
Assisting Advisor: Mach, Robert
Issue Date: 2007
Citation: 
Rudroff, F. (2007). Recombinant whole-cell mediated baeyer-villiger oxidation from parallel mini-scale screening to fermenter up-scaling for natural product synthesis [Dissertation]. reposiTUm. https://resolver.obvsg.at/urn:nbn:at:at-ubtuw:1-16160
Number of Pages: 197
Qualification level: Doctoral
Abstract: 
In den letzten Jahren hat die Synthese von enantiomeren reinen Verbindungen stark an Bedeutung gewonnen. Die Einführung von Enzymen als Katalysatoren in der organischen Synthese hat es ermöglicht unterschiedliche, aber sehr effiziente und neue enantioselektive Transformationen durchzuführen. Die Baeyer-Villiger Oxidation, benannt nach Adolf von Baeyer und Victor Villiger, repräsentiert eine Reaktion, bei der Ketone durch Insertion von molekularem Sauerstoff in die entsprechenden Ester umgewandelt werden. Die Möglichkeit eines C-C Bindungsbruches einer organischen Verbindung und Einführung einer neuen und vielseitig modifizierbaren funktionellen Gruppe macht diese Reaktion zu einem sehr wertvollen Werkzeug für die organische Synthese. In den letzten Jahren haben wir Zugang zu einer Reihe unterschiedlicher Baeyer-Villiger Monooxygenasen (BVMOs) mit bis dato unbekannten biokatalytischen Eigenschaften bekommen. Des weiteren haben wir eine Substanzbibliothek von strukturell unterschiedlichen Ketonen (prochiral und racemisch) synthetisiert um diese in den bereits beschrieben Biooxidationen zu untersuchen. Daher wurde die Entwicklung eines effizienten Screening-Verfahrens, basierend auf miniaturisierten "ganz-Zell" Biotransformationen immer wichtiger. Das Screening Verfahren war konzipiert für die Generierung von Daten basierend auf der Konversion und Stereoselektivität (bestimmt mittels GC-Analyse) in einem möglichst kurzen und Zeitraum. Das ermöglichte uns die rasche Evaluierung und Charakterisierung von BVMOs in "ganz-Zell" Biotransformationen mit rekombinanten Überexpressionssystemen. Nach der Entwicklung dieses Screening-Verfahrens war die Optimierung des Fermentationsprozesses für "ganz-Zell" unterstützte Baeyer-Villiger Oxidationen der nächste logische Schritt. Hierbei wurde ein spezielles Verfahren, das so genannte "SFPR" (2 in 1 in situ "Substrate Feeding and Product Removal") Konzept, welches auf der Verwendung von einem Adsorbent und einem rekombinanten E.coli Stamm basiert, der Cyclopentanone monooxygenase überexpremiert. Mittels dieses Verfahrens konnten schwerwiegende Probleme der "ganz-Zell" Fermentation, wie die Limitierung durch die Konzentration des Substrates oder die Toxizität der Reaktionspartner, im Gegensatz zu früheren Ergebnissen deutlich entschärft werden, was zu deutlich besseren Ergebnissen führte. Somit konnten wir die Synthese von chiralen Lactonen im Gramm-Maßstab realisieren und diese zugänglich für weitere synthetische Applikationen machen. Durch die deutliche Effizienzsteigerung des Fermentationsprozesses konnten wir die Anwendbarkeit der mikrobiellen BV-Oxidation an Hand eines konkreten Beispieles zeigen. Zu diesem Zwecke wurde eine neue, und bis dato kürzeste Synthesesequenz für die Herstellung von D-(+)-Showodomycin etabliert. Showdomycin ist ein sogenanntes C-Nucleosid, welches das erste Mal in Streptomyces showdoensis gefunden wurde, und zeichnet sich durch seine Bedeutung in der Krebs und HIV-Forschung aus. Durch die Entwicklung dieser Synthesesequenz konnte auch die Absolutkonfiguration des enzymatisch erhaltenen Bicyclischen BV-Oxidationsproduktes bestimmt werden.
Ein weiterer Teil der Arbeit befasste sich mit einer Bibliothek von BVMOs welche Zugang zu enantiokomplementären Lactonen ermöglichte. Diese wurden für die Synthese verschiedenster Butyrolactone verwendet, welche Vorstufen zu einer Vielzahl von Lignanen repräsentieren.
Das vollständige Konzept dieser Arbeit und deren Hauptziele sind folgend zusammengefasst:
Entwicklung eines schnellen und effizienten Screening - Verfahrens Fermentationsoptimierung von Baeyer-Villiger unterstützten "ganz-Zell" Biotransformationen Anwendung von BVMOs in neuen Synthesestrategien für die Herstellung von bioaktiven Verbindungen.

Biocatalysis offers a very cost efficient and environment-friendly process for the preparation of fine chemicals.
Especially during the last decades the synthesis of enantiomerically pure compounds increased dramatically. The introduction of enzymes as such catalysts into synthetic organic chemistry made possible many new highly enantioselective transformations. Baeyer-Villiger oxidation using biocatalysts represents a powerful methodology for the one-step asymmetric synthesis of chiral lactones. During the last years we obtained access to a large number of different Baeyer-Villiger monooxygenases (BVMOs) with so far unknown biocatalytic properties. We also synthesized a large library of structurally diverse ketones (prochiral and racemic) to be investigated in biooxidation reactions. Consequently, the development of an efficient screening methodology based on microscaled whole-cell biotransformations became mandatory. The screening protocol was designed to provide data for conversion and stereoselectivity (determined by chiral GC analysis) in a time efficient manner. This allowed the rapid evaluation and characterization of BVMOs in whole-cell biotransformations with recombinant overexpression systems. The fermentation optimization of whole-cell mediated Baeyer-Villiger oxidation was the next logical step upon identification of a promising biocatalyst-substrate couple of interest for future exploitation. A "two-in-one" in situ "substrate feeding and product removal" concept (SFPR) using an adsorbent resin and a recombinant E.coli strain overexpressing cyclopentanone monooxygenase (CPMO) was elaborated. Due to the limitations of substrate concentration and high toxicity of both starting material and product this SFPR methodology improved prior fermentation results significantly. Several critical parameters of the fermentation process were optimized and multi-gram quantities of chiral lactones became available for subsequent synthetic elaboration.
Application of the biooxidation products obtained with the optimized fermentation protocol was outlined in a short and efficient synthetic approach towards various C-nucleosides. D-(+)-Showdomycin, a natural C-nucleoside, which was first isolated from Streptomyces showdoensis, was chosen as a model substrate to demonstrate the applicability of enantioselective biooxidation reactions in natural product synthesis.
Within this shortest synthetic sequence to D-(+)-showdomycin reported so far starting from non-chiral precursors, also the absolute configuration for chiral lactones obtained by enzymatic BV-oxidation of prochiral bicycloketones could be established.
In another series a library of BVMOs providing access to enantiocomplementary lactones was utilized in the synthesis of various chiral butyrolactones as precursor for a diversity of lignans. The complete strategy of this thesis is outlined in Figure 2 and the major goals of this project were as follows:
Development of a rapid screening system for substrate profiling of BVMOs Fermentation optimization of BVMO mediated whole-cell biotransformations Application of BVMOs in novel synthetic approached to bioactive compounds Consequently, this thesis spans from biocatalyst assignment within screening protocols to up-scaling of the process to preparative quantities to, ultimately, applying this biotransformation in the synthesis of natural compounds.
Keywords: Enzymatische Baeyer-Villiger-Oxidation; Biocatalyse; "ganz-Zell" Biotransformation; D-(+)-Showdomycin; SFPR-Konzept; Fermentationsoptimierung
Enzymatic Baeyer-Villiger Oxidation; biocatalysis; whole-cell fermentation; D-(+)-showdomycin; SFPR concept; Fermentationoptimization
URI: https://resolver.obvsg.at/urn:nbn:at:at-ubtuw:1-16160
http://hdl.handle.net/20.500.12708/14623
Library ID: AC05033886
Organisation: E163 - Institut für Angewandte Synthesechemie 
Publication Type: Thesis
Hochschulschrift
Appears in Collections:Thesis

Files in this item:


Page view(s)

37
checked on Oct 20, 2021

Download(s)

106
checked on Oct 20, 2021

Google ScholarTM

Check


Items in reposiTUm are protected by copyright, with all rights reserved, unless otherwise indicated.