New concepts for two-photon micropatterning of biocompatible hydrogels

Abstract

Multiphotonen-Lithographie ist eine Hochleistungstechnologie, welche die Bearbeitungen licht- sensitiver Materialien unter Verwendung von gepulstem NIR-Laser Licht ermöglicht. Aufgrund ihrer einzigartigen Merkmale, einschließlich Freiform-3D-Strukturierung und Nichtinvasivität in Bereichen außerhalb des Fokusvolumens, ist diese Methode besonders für die Mikrostrukturie- rung von Hydrogelen in Gegenwart von Zellen geeignet. Neben Zweiphotonen-Polymerisation, bei der Strukturen aus einer Makromer-Formulierung aufgebaut werden, ermöglicht die Zwei- photonen-Degradierung vorgeformter photoaktiver Hydrogele die lokalisierte Bildung von Mikro- kanälen und in situ Modifizierung der Zellumgebung in der 4D-Zellkultur. Aufgrund der hohen Auflösung der Multiphotonen-Lithographie und der daraus resultierenden geringen Detailgrößen, ist die Maximierung der erreichbaren Schreibgeschwindigkeit mit dem Ziel die realisierbaren Objektabmessungen in den Zentimeter-Bereich zu bringen zurzeit von höchstem Interesse. Gemeinsam mit Fortschritten in der Maschinenkonstruktion können viele Verbesserungen durch Materialentwicklung und der Implementierung neuer Chemie erzielt werden, unter anderen um den Umfang der verarbeitbaren Materialien und erreichbaren Materialeigenschaften zu erhöhen. In dieser Arbeit sollen hierzu zweierlei Probleme angesprochen werden. Einerseits wurden zwei Triazin-basierte Chromophore synthetisiert und als Initiatoren für die Zweiphotonen-Polymerisation evaluiert, um das Portfolio an hocheffizienten Zweiphotonen- aktiven Substanzen zu erweitern. Zum anderen werden für die Bildung photospaltbarer Hydrogelen photolabile Bindungen in ein Netzwerk integriert. Allerdings ist die Reaktivität der meisten dieser Gruppen in Bezug auf Zweiphotonen Anregung eher gering, weshalb hohe Laserleistungen benötigt werden und die technisch erreichbaren Schreibgeschwindigkeiten nicht voll ausgeschöpft werden können. Um diese Materialklasse voranzutreiben, sollten existierende Methoden verbessert und neue Photo- chemie evaluiert werden. In Konzeptstudien wurden neuartige Moleküle erarbeitet, die im Zuge eines Radikal-Angriffs gespalten werden könnten, sowie ein wasserlösliches AFCT-Reagenz synthetisiert und im Hinblick auf seine Eignung zur Spaltung von Disulfidbindungen getestet. Weiters wurde ein Konzept für die sensibilisierte Zweiphotonen-Spaltung von o-Nitrobenzyl (oNB), der am häufigst verwendeten photospaltbaren Gruppe, entwickelt und umfangreich getestet. Die Bioverträglichkeit dieses Prozesses wurde dabei in Gegenwart von Stammzellen demonstriert. Dieser Ansatz wurde dann auf wesentlich einfachere Disulfidbindungen übertragen, um die Zweiphotonenspaltung dieser Gruppe zu ermöglichen und die Verwendung von oNB zu umgehen. Zur Erleichterung der Bildung Disulfid-basierter Netzwerke ausgehend von Thiol- terminierten Makromeren wurde ein Disulfid-Linker für die lichtinduzierte Bildung solcher Netzwerke unter Verwendung von Thiol-En-„Click“ Chemie entwickelt. Die Anwendbarkeit dieser neuen Hydrogel-Plattform sowie der sensibilisierten Zweiphotonenspaltung wurde dann durch Zellkulturstudien bestätigt.

Multiphoton lithography is a powerful technology that permits the processing of light-sensitive materials by the use of pulsed NIR laser light. Owing to its unique features, including free-form 3D-patterning and the non-invasiveness to areas outside the focal volume, this method is particularly suited for micropatterning of hydrogels in the presence of cells. Besides two-photon polymerization where scaffolds-like constructs are built in a bottom-up approach from a macromer formulation, two-photon degradation of pre-formed photoactive hydrogels allows for localized microchannel formation or in situ modification of cell surroundings in 4D cell culture approaches. Due to the high resolution multiphoton lithography offers and the resulting small feature sizes of created constructs, maximizing the achievable writing speed, with the aim to push the feasible spatial dimensions in the cubic centimetre regime, is a current key interest. Along with advances in machine design and engineering, much improvement can be achieved in material development and the implementation of new chemistries to extend the range of processable materials and accessible materials properties. Within this thesis, two problems were addressed. On the one hand, to expand the portfolio of highly efficient two-photon active compounds, two triazine-based chromophores were synthesized and evaluated as initiators for two-photon polymerization at two different technically relevant fs-laser wavelengths. On the other hand, for photodegradable hydrogels photolabile bonds are integrated into a hydrogel network. However, as the reactivity of most respective groups towards two-photon excitation is rather low, high laser powers need to be applied and technically achievable writing speeds cannot be fully exploited. To advance this material class, existing methods should be improved and new photochemistries should be evaluated. In concept studies, novel cleavable molecules, which could be fragmented upon radical attacks, were designed and tested, and a water-soluble thiyl-releasing AFCT-reagent was synthesized and evaluated concerning its applicability for the cleavage of disulfide-bonds. Moreover, a concept for sensitized two-photon cleavage of o-nitrobenzyl (oNB), the currently most used photolabile group, was developed and extensively tested. The biocompatibility of the process was demonstrated in the presence of stem cells. This approach was then translated onto much simpler disulfide linkages, in order to permit the two-photon cleavage of this functionality and avoid the use of oNB. In addition, to facilitate the formation of disulfide-based networks from thiol-terminated macromers, a disulfide containing photo-linker for the light-induced formation of such networks by thiol-ene “click” chemistry was developed. The applicability of this new hydrogel platform as well as the sensitized two-photon cleavage was finally confirmed by cell culture studies.