Quantifying conformational dynamics of biomolecules via single-molecule FRET

Abstract

Förster-Resonanzenergietransfer (FRET) wird oft in Verbindung mit Fluoreszenzmikroskopie genutzt, um in biologischen Proben Distanzen im einstelligen Nanometerbereich zu messen. Im Rahmen dieser Dissertation wurde ein molekularer Kraftsensor entwickelt, dessen Herzstück ein nanoskopisches, feder-artiges Peptid bildet. Die Streckung des Peptids und folglich die an ihm wirkende Kraft wurde über Einzelmolekül-FRET ausgelesen. Mit Hilfe dieses Sensors wurde eine der entscheidenden offenen Fragen in der Immunologie untersucht: Spielen mechanische Kräfte bei der Aktivierung von T-Zellen eine Rolle? Zu diesem Zwecke wurden Sensoren auf künstlichen, planaren Lipid-Doppelschichten (supported lipid bilayers, SLBs) verankert, welche die Zellmembran Antigen-präsentierender Zellen simulierten. Primäre Maus-T-Zellen interagierten über ihre T-Zell-Rezeptoren mit den Sensoren, wodurch das Auftreten von Kräfte zwischen einzelnen Rezeptoren und Liganden nachgewiesen werden konnte. Abhängig von der SLB-Viskosität unterschieden sich die Ergebnisse teils erheblich. Auf Bilayern in Gelphase, auf denen die Sensoren praktisch immobilisiert waren, traten Kräfte im mittleren einstelligen Piconewtonbereich auf. Dies konnte sowohl bei Aktivierung der Zellen durch eine hohe Ligandendichte, als auch bei Zellen, die SLBs nach Liganden in niedriger Dichte abtasteten, beobachtet werden. Im Gegensatz dazu wurden auf SLBs in Flüssigphase, auf welchen die Sensoren frei diffundieren konnten, keine Kräfte durch aktivierte T-Zellen registriert, während bei niedriger Ligandendichte vergleichsweise geringe Kräfte auftraten. Dies ließ den Schluss zu, dass T-Zell-Rezeptoren hauptsächlich parallel zur Zellmembran gezogen werden und Kräfte über etwa 2pN für die T-Zell-Aktivierung keine nennenswerte Rolle zu spielen scheinen. Weiters konnte mit Hilfe des Sensors der zeitliche Verlauf der Kraftausübung bestimmt werden. Es wurde festgestellt, dass die Kraft über einen Zeitraum von einigen Sekunden kontinuierlich zunimmt, bevor sie sprunghaft auf null zurückgeht. Einzelmolekül-FRET wird zudem oft verwendet, um dynamische Parameter von Biomolekülen, wie zum Beispiel Konformationsänderungsraten, zu bestimmen. Dazu können entweder die zeitlichen Fluktuationen von FRET-Effizienzen analysiert werden, oder man wertet direkt die statistischen Verteilungen der Effizienzwerte (probability density analysis) aus. Im Zuge dieser Dissertation wurde eine Variante letzterer Technik entwickelt, bei der experimentelle Daten mittels statistischer Tests mit einer umfassenden Menge an simulierten Datensätzen verglichen werden. Die resultierenden p-Werte erlauben es, jene Parameter zu verwerfen, die mit hoher Wahrscheinlichkeit nicht zum experimentellen Ergebnis geführt haben. Es wurde mit Hilfe von computergenerierten, pseudo-experimentellen Daten gezeigt, dass auf diese Weise der Raum konsistenter Parameter sehr stark eingeschränkt werden kann und so Rückschlüsse auf die dem experimentellen System zugrunde liegenden physikalischen Größen möglich sind. Weiters wurde nachgewiesen, dass die Methode robust in Bezug auf die ungenaue Bestimmung von Eingabeparametern für die Simulationen ist. Schließlich wurde die Technik an Holliday-Strukturen erfolgreich experimentell erprobt, indem die Lebensdauern ihrer Konformationszustände bestimmt wurden.

Förster resonance energy transfer (FRET) is widely used in combination with fluorescence microscopy to measure single-digit nanometer distances in biological samples. In conjunction with this thesis, a force sensor based on a nanoscopic, spring-like peptide was developed, whose extension and consequently the administerd force was read out via single-molecule FRET. The sensor was used to investigate a critical yet unresolved question in immunology: Do mechanical forces play a role in the activation of T cells? To find out, sensor molecules were anchored on planar supported lipid bilayers (SLBs), which served as surrogate antigen-presenting cell membranes. Primary mouse T cells interacted via their T cell receptors with the sensors, allowing for the measurement of forces on a single-receptor level. Depending on the SLB viscosity, substantially different results were obtained. When using gel-phase bilayers, on which the sensors were virtually immobilized, mid-level single-digit piconewton forces were found. This held true when activating the cells employing high ligand densities as well as for T cells scanning for low-density ligands. Contrary to that, when using fluid bilayers enabling free diffusion of the sensor molecules, no forces were found when activating the T cells, while low forces arose under scanning conditions. This led to the conclusion T cell receptors are pulled mainly parallel to the T cell membrane and that forces above 2pN seem to play no substantial role in T cell activation. Additionally, the sensor constructs permitted measuring the time course of force application, revealing that the force magnitude increases on the time scale of seconds followed by a step-like decline to zero. Single-molecule FRET is often employed for determination of dynamical parameters of biomolecules, such as conformational transition rates. This can be achieved by analyzing FRET efficiency time traces or by directly evaluating the distribution of FRET efficiency values (probability distribution analysis). As part of this thesis, a new variant of the latter technique was developed which uses statistical hypothesis testing to compare the experimental results to a comprehensive set of simulated datasets. The resulting p-values allow for discarding parameters which show a high probability of not leading to the experimental outcome. With help of computer-generated pseudo-experimental data it was demonstrated that this method greatly restricts the space of consistent parameters, thereby permitting to infer the physical quantities governing the experimental system. Furthermore it was found that the method is robust concerning inaccurately determined input parameters to the simulations. Finally, the viability of the technique was verified in an experimental context by determining the lifetimes of the conformational states of Holliday junctions.