3D Rekonstruktion der E3 Ligase LUBAC mittels Kryo-Elektronen Mikroskopie

Abstract

Der Lineare Ubiquitin Chain Assembly Complex (LUBAC) ist die einzig bekannte Ubiquitin Ligase, die lineare Ubiquitinketten generiert. In der Vergangenheit konnte gezeigt werden, dass LUBAC ein essentieller Agonist in der NF-kB Kaskade ist und somit in Entzündungsreaktionen und immunologischen Reaktionen involviert ist. LUBACs Untereinheiten konnten einzeln bereits rekonstruiert werden, jedoch ist es bislang nicht gelungen eine hoch aufgelöste 3D Struktur des vollständigen LUBAC zu erlangen. Diese Arbeit präsentiert sowohl ein optimiertes Verfahren um LUBAC mit hoher Reinheit und Integrität aufzureinigen, als auch eine 3D Rekonstruktion des Proteins. Es werden außerdem die Eigenschaften des LUBACs auf kryo-EM Probengittern unter verschiedenen Konditionenuntersucht und analysiert. Dabei konnte gezeigt werden, dass die Adhäsion von LUBAC zur Wasseroberfläche für die Dissoziierung des Proteins verantwortlich ist und somit zu einer verminderten Auflösung in der Rekonstruktion führt. Die Immersion der Teilchen konnte mittels verschiedener Methoden verbessert werden. Die Totzeit zwischen dem Abtupfen des kryo-EM Gitters und dem Eintauchen in flüssiges Ethan muss stark reduziert werden um die Adhäsion von LUBAC Teilchen an die Wasseroberfläche zu verhindern.

The linear ubiquitin chain assembly complex (LUBAC) is the only known ubiquitin ligase for linear/M1-linked ubiquitin chain formation. It was shown that LUBAC is an essential agonist in the NF-kB pathway and thus involved in inflammation and immunesignalling. Many structures of the subunits of LUBAC bound to other proteins have beenreconstructed already; however, a high-resolution 3D reconstruction of the human LUBACcould not be achieved yet. This project presents an optimized purification procedure forLUBAC with very high purity and integrity, as well as a 3D reconstruction at low resolution. The exceptional behaviour of LUBAC on cryo-EM grids under various grid conditions and modifications was analysed and described. This thesis found that the adhesionof LUBAC to the air-water-interface on cryo-EM grids heavily reduces resolution, as itcauses LUBAC to disassemble. Particle immersion into solution could be improved; however, not fully overcome. The delay time between blotting and plunge freezing needs tobe drastically reduced, to inhibit the adsorption of LUBAC to the air-water interface.