Discovery, redesign, and stabilization of cyclohexanone monooxygenase (CHMO)

Abstract

Unter der hohen Anzahl an Flavin-abhängigen Monooxygenasen wurden Baeyer-Villiger-Monooxygenasen (BVMOs) am häufigsten für ihre Anwendung als Biokatalysator untersucht. Eine herausragende Anwendung dieser Biokatalysatoren ist die stereoselektive Oxidation von aliphatischen und cyclischen Ketonen zu entsprechenden Estern / Lactonen, welche wesentliche Bausteine für die Synthese bioaktiver Verbindungen sind. Die Prototyp BVMO, Cyclohexanonmonooxygenase aus Acinetobacter calcoaceticus NCIMB9871 (CHMOAcineto), ist aufgrund ihres breiten Substratspektrums und seiner hervorragenden Regio-, Chemo- und Enantioselektivität ein vielversprechender Biokatalysator für die industrielle Anwendung. Die geringe Stabilität von CHMOAcineto und vielen anderen Baeyer-Villiger-Monooxygenasen ist jedoch ein Hindernis für ihre Nutzung in der Industrie. Dieses Projekt zielt darauf ab, dieses bedeutende Hindernis auf dem Transitweg zu überwinden, um die Stabilität durch Protein-Engineering und Genom-Mining zu verbessern.CHMOAcineto wurde als am meisten untersuchte BVMO für diese Studie ausgewählt. Mutationen zur Stabilisierung von Helixstrukturmotiven und zur Stabilisierung der Enzym-FAD-Bindung wurden vorhergesagt. Kombinatorische und rationale Proteindesign-Ansätze wurden für die Entwicklung von drei Generationen von Mutanten angewendet. Diese Varianten wurden auf ihre Thermostabilität und Aktivität untersucht. Ausgewählte thermisch und kinetisch stabile Varianten wurden ebenfalls mit mehreren Substraten untersucht, um anzuzeigen, ob sie nach der Modifikation ihre Selektivität beibehielten. Die kinetische Stabilität von CHMOAcineto bei 30 ° C verbesserte sich von 34 min auf 275 min (3. Mut-4). Dies wurde ohne Aktivitätsverlust erreicht, was diese Variante zu einem wertvollen Biokatalysator mit einer angemessenen Halbwertszeit und einer hohen Gesamtumsatzzahl (TTN) für industrielle Anwendungen macht. Die nach den Screenings erhaltenen Ergebnisse zeigten, dass unsere beste kinetisch stabile Variante keine signifikanten Änderungen in ihrem Substratprofil zeigt. Der Grund für die Verbesserung der Stabilität wurde durch rationales Protein-Engineering und molekulardynamische Simulationen erforscht, wobei ein Hot Spot in der Aminosäureposition 14 von CHMOAcineto enthüllt wurde.In einem Nebenprojekt wurde der Metagenomansatz verwendet, um die umfangreiche Datenerfassung von BVMOs zu untersuchen und einen thermostabilen Biokatalysator als Alternative für CHMOAcineto zu finden. Dieser Ansatz führte zu einer neuartigen BVMO (BVMOFlava), die eine moderate kinetische Stabilität und eine hohe thermodynamische Stabilität aufwies. Die hohe Abweichung zwischen thermodynamischer und kinetischer Stabilität ist ein bedeutendes Problem auf dem Gebiet der BVMO-Forschung, da häufig nur Tm-Werte ohne Bezug zur tatsächlichen Betriebsstabilität angegeben werden. Diese Studie unterstreicht, wie wichtig es ist, sowohl Stabilitäten für zukünftige Vergleiche als auch mutmaßliche industrielle Anwendungen von BVMOs zu bestimmen.Eines der wichtigsten Ergebnisse der Arbeit ist, dass eine erhöhte Affinität von FAD zum Enzym zu einer signifikanten Erhöhung der kinetischen Stabilität führt. Darüber hinaus zeigt die Leistungsfähigkeit des Protein-Engineerings, wie die Enzymeigenschaften verbessert werden können, und zeigt das hohe Potenzial von Genomdatenbanken, auch neuartige Biokatalysatoren untersuchen und identifizieren zu können.

Among the high number of flavin-dependent monooxygenases, Baeyer–Villiger monooxygenases (BVMOs) have been studied most for their application as a biocatalyst. A prominent conversion of these biocatalysts is the stereoselective oxidation of aliphatic and cyclic ketones to corresponding esters/lactones that are essential building blocks for the synthesis of bioactive compounds. The prototype BVMO, cyclohexanone monooxygenase from Acinetobacter calcoaceticus NCIMB9871 (CHMOAcineto), is a promising biocatalyst for industrial application owing to its broad substrate spectrum and excellent regio-, chemo-, and enantioselectivity. However, the low stability of CHMOAcineto and many other Baeyer–Villiger monooxygenases is an obstacle for their exploitation in the industry. This project is aiming to overcome this significant obstacle in transit to improve stability by using protein engineering and genome mining.CHMOAcineto, as the most studied BVMO, was chosen for this study. Mutations to stabilize helical structure motifs and also stabilizing enzyme-FAD binding were predicted. Combinatorial and rational protein design approaches were applied for the development of three generations of mutants. These variants were screened for their thermostability and activity. Selected thermally and kinetically stable variants were also screened with several substrates to indicate if they retained their selectivity after the modification. Kinetic stability of CHMOAcineto at 30°C improved from 34 min to 275 min (3rdmut-4); this was achieved by no loss in activity, which turns this variant to a valuable biocatalyst with a reasonable half-life and a high total turnover number (TTN) for industrial applications. The results obtained after the screenings showed that our best kinetically stable variant does not show any significant changes in its substrate scope. The reason for the improvement of stability was addressed by rational protein engineering and molecular dynamic simulations, which revealed a hot spot in the amino acid poition 14 of CHMOAcineto. In a side project, metagenome mining was used to explore the vast data collection of BVMOs to find a thermostable biocatalyst as an alternative for CHMOAcineto as well. This approach resulted in a novel BVMO (BVMOFlava) that showed moderate kinetic stability and high thermodynamic stability. The high deviation between thermodynamic and kinetic stability is a significant problem in the field of BVMO research, since often only Tm values are reported without any perspective to the actual operational stability. This study helps to emphasize how important it is to determine both stabilities for future comparison and putative industrial applications of BVMOs.Major findings of the thesis are that an increased affinity of FAD to the enzyme leads to a significant increase in kinetic stability; furthermore the power of protein engineering demonstrates how to improve enzyme characteristics and shows the high potential of genome databases to investigate and identify novel biocatalysts as well.