Development of chemical tools for bioorthogonal stapling of RNA

Abstract

RNA-Targeting-Medikamente stellen ein enormes Potential für die Behandlung verschiedener Erkrankungen dar. Antisense-Oligonukleotide (ASOs) gehören dabei zu den vielversprechendsten Ansätzen. Die hohe Selektivität gegenüber einer spezifischen Sequenz der Ziel RNA, sowie die leichte Anpassbarkeit der Sequenz, um etwaigen Mutationen entgegenzuwirken, zeichnen die ASOs dabei aus. Mit der Entwicklung neuer, mit bioorthogonalen Funktionalitäten modi-fizierter ASOs möchten wir diese Vorteile nutzen. Diese binden mit hoher Selektivität an die Ziel-RNA und lösen dabei eine bioorthogonale Ligationsreaktion aus, die zur mechanischen Blockade der Ziel-RNA führt. Ein Prozess den wir insgesamt als„bioorthogonal stapling of RNA – bioSTAR“ bezeichnen. Diese funktionalisierten ASOs sollen in Zukunft genutzt werden, um Einblicke in zelluläre Prozesse zu gewinnen und eine Plattform für diverse Ansätze bereitstellen, wie z.B. die sequenz-spezifische Wirkstofffreisetzung. Unter den vorgesehenen Konzepten befinden sich modifizierte ASOs, die mit zwei, zueinander reaktiven, bioorthogonalen Funktionalitäten ausgestattet sind. Im Rahmen der Bildung des Ziel-RNA-ASOs-Hybrids kommt es zu einer sterischen Nähe der bioorthogonalen Funktionalitäten und damit zur Erhöhung der lokalen effektiven Konzentration, wodurch die bioorthogonale Reaktion beschleunigt wird. Nachdem die bioorthogonalen Funktionalitäten eine hohe Reaktivität zueinander einander aufweisen, stellt die Synthese dieser modifizierten ASOs eine große Herausforderung dar. Im Rahmen dieser Arbeit wurden deshalb diverse, mit Licht aktivierbare Tetrazine synthetisiert, die eine Steuerung der Reaktivität ermöglichen. Dabei werden Tetrazin-Vorstufen, mit photolabilen Schutzgruppen ausgestattet, welche die Bildung der reaktiven Tetrazine temporär verhindern. Die Abspaltung der Schutzgruppe mit sichtbarem Licht, ermöglicht anschließend die Reaktivität gezielt „einzuschalten“. In einem weiteren Ansatz sollen bioorthogonalen Eliminationsreaktionen genutzt werden, um gezielt Moleküle freizusetzen. Hierfür wurden im Rahmen dieser Arbeit spezielle Vinylether synthetisiert, die durch die Reaktion mit Tetrazinen ein Molekül freisetzen und gleichzeitig die Blockade des Hybrids lösen. Damit kann die Ziel-RNA wieder freigesetzt werden, eine weitere Reaktion eingehen und somit eine zielsequenzbasierte katalytische Freisetzung von Wirkstoff ermöglichen.

RNA targeting therapeutics offer a tremendous potential for the treatment of various disorders and diseases. The most promising among these include antisense oligonucleotides, which exhibit high selectivity towards a specific sequence of the target RNA and the unique ability to pharmacoevolve, meaning that these therapeutics can be easily adapted to keep pace with mutations. By taking advantage of these abilities, we aim to develop antisense probes that bind to the target RNA and trigger a subsequent bioorthogonal ligation, mechanically interlocking the target strand. A process we overall term bioorthogonal stapling of RNA (bioSTAR). We envisage that these functionalized antisense probes can be exploited to gain further insight into cellular processes and provide a platform for different therapeutic approaches, such as sequence-specific drug delivery. Within bioSTAR different stapling antisense probes (SAPs) are envisioned, including self-locking SAPs, consisting of two bioorthogonal tags, which are reactive towards each other. The hybridization of these SAPs with the target RNA results in a template triggered steric proximity of the bioorthogonal tags, and therefore in an increase of the effective concentration leading to an acceleration of the subsequent bioorthogonal reaction. However, with the presence of two highly reactive bioorthogonal tags within one molecule certain challenges arise (e.g., undesired reactions prior to reaching the target RNA). Within this thesis several photoactivatable tetrazines were synthesized as chemical tools aiming to gain spatio-temporal control over the reactivity of the bioorthogonal tags. These photoactivatable tetrazines consist of unreactive tetrazine precursors (1,4-dihydrotetrazines), decorated with photoactivatable protecting groups, which enable to turn on the reactivity upon light irradiation, using visible light. Furthermore, bioorthogonal bond-cleavage reactions are exploited with the aim to achieve target-mediated release of molecules (e.g., drugs and dyes). In this context robust vinyl ether release systems were synthesized, facilitating the realization of non-lock release probes. These non-lock antisense probes enable the click-triggered release of a molecule and simultaneously result in the unstapling of the target RNA, which can participate in subsequent reactions over and over again, resulting in a sequence-specific amplified drug release.