Das auf der „Tetrazin Ligation“ basierende Click-to-Release Konzept ist bereits ein wichtiger Bestandteil verschiedener in vitro Anwendungen. Hierbei wird eine carbamatisch gebundene funktionelle Gruppe in der allylischen Position eines trans-Cyclooktens (rTCO) durch die Reaktion mit einem 1,2,4,5-Tetrazin (Tz) abgespalten. Die anfänglich geringen Abspaltungsgeschwindigkeiten, konnten durch die Verwendung von Tz, welche mit einer dirigierenden Gruppe funktionalisiert sind, verbessert werden. Ein gleichzeitig schneller und vollständiger Release blieb jedoch unerreichbar. Daher entwickelte unsere Gruppe ein C2 symmetrisches TCO (C2TCO) mit einer zweiten Abgangsgruppe in der freien allylischen Position. Durch dieses Design zeigt auch bei zufälliger Click Richtung nicht nur ein Click Produkt (head-to-head, 50%) schnellen Release, wie bisher, sondern schnelle und quantitative Abspaltung wird erreicht. Obwohl es nicht kontrollierbar ist, welche Abgangsgruppe freigesetzt wird, eignet sich dieses modifizierte „Click-to-Release“ Konzept mit C2TCO ideal für „Turn-Off“ Anwendungen, wie die Deaktivierung von Biomolekülen, in denen quantitative Abspaltung essenziell ist. Unerwarteterweise beobachteten wir, dass C2TCO Derivate nicht nur quantitativ eine Abgangsgruppe abspalten, sondern zusätzlich auch die zweite eliminieren können, das heißt einen so genannten „Double Release“ ausführen. Um diese neue Entdeckung zu bestätigen und weiter zu erforschen, wurden Medikament-C2TCO-Medikament Derivate synthetisiert. Deren chemische „Double Release“ Effizienz wurde mittels zeitaufgelösten HPLC-MS Messungen evaluiert, welche hohe bis quantitative „Double Release“ Ausbeuten zeigten. Die Effizienz des bioorthogonalen „Double Releases“ wurde in Zellversuchen bestimmt, in denen die neuen Derivate als Prodrugs wirken, die durch Reaktion mit Tz aktiviert werden. Gute bis exzellente Aktivierungsfaktoren wurden für die verschiedenen Verbindungen bestimmt.
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Based on the tetrazine ligation, the bioorthogonal click-to-release methodology already represents a powerful tool for various in vitro applications. Herein, a carbamate-linked moiety in the allylic position of a trans-cyclooctene (rTCO) is cleaved upon the ligation with a 1,2,4,5-tetrazine (Tz). However, the initially proposed system suffered from low release rates and yields. By using tetrazines functionalized with one directing group, the release efficiency could be improved but simultaneously fast and complete release remained impossible. Thus, our group developed a C2-symmetrical TCO (C2TCO), introducing a second leaving group in the remaining allylic position.Hence, it is circumvented, that only one click product (head-to-head), which is only formed to 50% due to random click orientation, promotes ultrafast release and omnidirectional fast and complete release is achieved Although it cannot be controlled which leaving group is cleaved, this modified click-to-release approach with C2TCO could be ideally utilized for turn-off applications, like biomolecular inactivation, where quantitative cleavage events are crucial. Unexpectedly, we observed that C2TCO derivatives are not only capable to undergo complete cleavage of one leaving group but can also release the second one, performing a so-called double release.To confirm and further investigate this novel finding, drug C2TCO drug derivatives were synthesized. Their chemical double release performance was evaluated by time-resolved HPLC-MS measurements, showing high to quantitative double release yields. The bioorthogonal double release performance was determined in cell viability experiments utilizing the novel derivatives as prodrugs, activatable by the click-to-release reaction with Tz. Good to excellent activation factors could be observed with the different probes.
