Application of Baeyer-Villiger monooxygenases in fine and bulk chemical synthesis

Abstract

Das Hauptziel dieser Arbeit ist die Entwicklung von Beispielprozessen zur Veranschaulichung der Anwendbarkeit von Baeyer- Villiger Monooxygenasen (BVMOs) in der industriellen Biokatalyse. Diese Enzymklasse wurde in akademischen Projekten auf dem Gebiet der Biochemie und Biokatalyse weitgehend erforscht und wird generell als besonders selektiv beschrieben. Das daraus erwachsene Wissen sollte as Fundament für diese Arbeit dienen. Die drei Hauptkapitel dieser Dissertation spiegeln die Entstehung eines Industrieprozesses wider: Katalysatorermittlung und systematische Studien, Interpretation und Ergebnisevaluierung mittels theoretischer Hilfsmittel und schließlich die Prozess-entwicklung. Der erste Teil befasst sich sowohl mit der Erstellung von Substratprofilen neuer Mono-oxygenasen in analytischen Parallelreaktionen, als auch mit der gezielten Analyse von BVMO-Katalyse in ausgewählten Verbindungsklassen. Es wurden somit wertvolle Erkenntnisse über biochemische und strukturelle Zusammenhänge von 13 neuen BVMOs und drei Flavin-Monooxygenasen gewonnen und neue Einsatzmöglichkeiten in der organischen Synthesechemie entdeckt. Die substratspezifischen Untersuchungen waren auf industriell relevante Zwischenprodukte und Aromachemikalien ausgerichtet, um die katalytische Leistung von BVMOs anhand folgender Beispiele zu demonstrieren: * Synthese von 3-Hydroxypropionsäure, einer wichtige Grundchemikalie, aus Laevulinsäurederivaten. * Aerangis-Lacton, eine weitverbreitete Aromaverbindung. * Duftstoffe aus Mangofrüchten und Jasminpflanzen. * Monomere für die Produktion von Polyamid-9-Materialien. Weitere Studien zur Synthese von Aromastoffen und die Entwicklung dynamischer kinetischer Racematspaltungen mittels BVMO-Katalyse waren weniger erfolgreich, wurden jedoch trotzdem aus akademischem Blickwinkel detailliert erforscht. Der zweite Teil dieser Arbeit beschreibt die Entwicklung theoretischer Hilfsmittel zur Datenorganisation, ihrer Beurteilung, Visualisierung und Interpretation. Zu diesem Zweck wurde eine relationale Datenbank für Biotransformations-ergebnisse erstellt; diese dient als Grundlage für einen quantitativen Beurteilungs- algorithmus mit grafischer Auswertung, welcher anhand von Cyclododecanon Monooxygenase aus Rhodococcus ruber, einem sehr vielseitigen Enzym, erfolgreich demonstriert werden konnte. Zum Abschluss dieses Kapitels werden Ergebnisse aus einer Untersuchung über die Regioselektivität von BVMOs präsentiert; daraus konnte weiters ein beschreibendes in silico Modell für BVOx von Diketonen entwickelt werden. Der Höhepunkt der Arbeit ist schließlich die Entwicklung dreier Beispielprozesse für die potentielle Anwendbarkeit von BVMOs. An erster Stelle steht die effiziente Produktion von Ethyl-3-acetoxypropionat mithilfe einer Mutanten-BVMO (17 g L-1d-1). Als zweites Beispiel wurde natürliches Aerangis-Lacton in perfecter optischer Reinheit in einer produktiven chemo-enzymatischen Sequenz, die in einem Schritt betrieben werden kann, hergestellt. Zuletzt wurden BVMOs als unselektive chirale Katalysatoren in der Synthese eines Schlüsselbausteines für Polyamid-9-Monomere eingesetzt; zusätzlich wurde der folgende Prozesschritt der Ester- Pyrolyse in Hinblick auf thermischen Anforderungen optimiert. Damit konnte das Hauptziel dieser Arbeit, das Aufzeigen von Verwendungsmöglichkeiten von BVMOs in Fein- und Grundchemikaliensynthese, wirkungsvoll unterstützt werden.<br />

The fundamental subject of this thesis is the development of showcase scenarios for the potential applicability of Baeyer-Villiger monooxygenases (BVMOs) in industrial biocatalysis. This enzyme class has been extensively studied in academic biochemistry and biocatalysis research and is usually described as highly selective in all chemical aspects. The knowledge gained in these studies was taken as the basis for this work. The evolution of an industrial process is mimicked by three main chapters: catalyst discovery and systematic studies, refinement and evaluation by supporting theoretical models and, eventually, catalyst and process engineering. Part one is divided in two fields: substrate profiling of novel monooxygenases for their performance in Baeyer-Villiger oxidations (BVOx) in parallel reactions on analytical scale, and systematic investigations of BVOx of defined substrate classes. The former studies provided valuable insight on substrate promiscuity and catalytic performance of 13 BVMOs and three flavin monooxygenases, allowing interpretation of biochemical and structural relationships and evaluation of these enzymes as tools in synthetic organic chemistry. Substrate-specific studies were mainly aimed at industrially relevant intermediates and aroma compounds and thus demonstrated the possibility to apply BVMOs in the synthesis of: * Platform chemical 3-hydroxypropionic acid via BVOx of Levulinic acid derivatives * Aerangis lactone, a widely used fragrance compound. * Aroma lactones from Mango and Jasmine fruits and plants. * Monomers for the production of polyamid-9 materials. Other investigations in the synthesis of aroma compounds and efforts to facilitate dynamic kinetic resolutions via BVMO catalysis were not met with equal success, but still scrutinized from an academic point of view. The second part of the thesis deals with the development of theoretical tools for data organization, evaluation, visualization and interpretation. On this account a relational database for BVMO transformation results was implemented, serving as basis for the development of a quantitative catalyst scoring algorithm with graphic output. The potential of this analysis was illustrated with cyclododecanone monooxygenase from Rhodococcus ruber, a very versatile biocatalyst. Additionally, this chapter contains a systematic study on the regioselectivity of BVMOs, ultimately leading to a very accurate descriptive in silico model for BVOx of diketones. The research conducted within this thesis then culminates in the development of three showcase processes demonstrating the application potential of BVMOs in industrial biotransformations. First, a mutant enzyme is used in the optimized biocatalytic synthesis of platform chemical ethyl 3-acetoxypropionate at a calculated productivity of 17 g L-1d-1. Second, natural Aerangis lactone is produced in perfect optical purity via a highly efficient chemo- enzymatic sequence process (121 g d-1), requiring just a single operation step. Third and last, BVMOs are used as unselective chiral catalysts in the synthesis of a key intermediate in polyamid-9 monomer synthesis, complemented by a thermally optimized ester pyrolysis reaction. These examples strongly support the aim of this work, propagating the use of BVMOs in fine and bulk chemical synthesis.