Analysis of reconstituted and native collagen fibrils modified by mineralization

Abstract

Kollagene sind die häufigsten und strukturell sowie mechanisch wichtigsten Proteine der menschlichen extrazellulären Matrix. Daraus ergibt sich, dass die mechanischen Eigenschaften der Grundbausteine in der hierarchischen Struktur der Gewebe, der sogenannte Kollagenfibrillen in mineralisierter sowie nicht mineralisierter Form, von entscheidender Bedeutung sind. Generell gibt es wenig wissenschaftliche Daten in Bezug auf die mechanischen Eigenschaften von Kollagenfibrillen; insbesondere liegen für mineralisierte Kollagenfibrillenüberhaupt keine Daten vor. In diesem Zusammenhang ist auch der in vitroMineralisierungsprozess von Kollagenfibrillen in Bezug auf deren mechanischenEigenschaften noch nicht untersucht worden. Daher war es das Ziel dieser Arbeit, die mechanischen Eigenschaften von in vitro mineralisierten nativen und rekonstituierten Kollagenfibrillen in verschiedenen Mineralisierungsstadien unter Verwendung von Rasterkraftmikroskopie (AFM) im Nanoindentationsmodus zu untersuchen. Hierfür wurde ein Messprotokoll entwickelt, welches die Untersuchung mehrerer Fibrillen innerhalb der gleichenMessreihe erlaubt. Zunächst wurden hier native und rekonstituierte Fibrillen selektiert und unter Verwendung von AFM im Kontaktmodus abgebildet. In weiterer Folge wurden diese selektierten Fibrillen zuerst in PBS-Puffer bei 37 °C für entweder 2 Stunden oder 48 Stunden vorkonditioniert. Danach wurden von den bereits ausgewählten Fibrillen mittels AFMNanoindentation sogenannte Indentationskarten in PBS auf einer Probenfläche von 1 × 2 μm aufgenommen. Danach wurde der Mineralisierungsprozess durch Hinzufügen einer Mineralisierungslösung eingeleitet. Darauffolgend wurden weitere Indentationskarten entweder sofort nach Initialisierung der Mineralisierung oder nach 20, 40 und 60 Stunden Mineralisierungszeit gemessen. Pro Indentationskarte wurden 16 Indentationspunkte auf derLängsachse, und mindestens 10 auf der Querschnittsachse der Fibrille gemessen. Für die Analyse der Messdaten wurde ein Matlab-Skript verwendet um Fibrillenhöhe sowie Indentationsmodul zu berechnen. Die mechanischen Eigenschaften der Proben wurden über die einzelnen Mineralisierungsstufen hinweg verglichen. Die Ergebnisse zeigen, dass rekonstituierte Fibrillen den mechanischen Eigenschaften nativer Proben ähneln und einegeringere Variation des Indentationsmoduli zwischen verschiedenen Fibrillen aufweisen. Der Mineralisierungsprozess hat offensichtlich Kristallbildung auf der Oberfläche von Fibrillen zur Folge. Das Vorhandensein einer intrafibrillären Mineralisierung wurde durch die Ergebnisse nahegelegt, konnte jedoch nicht mit statistischer Genauigkeit nachgewiesen werden. EDTA wurde nach einigen Mineralisierungsschritten zur wirkungsvollen Reinigung von auftretenden Oberflächenkristallen eingesetzt, konnte aber gegebenenfalls auch intrafibrilläreMineralablagerungen reduzieren oder ganz auflösen. Im Zuge der Arbeit konnte eine signifikante Reduzierung der Indentationssteifigkeit aufgrund von Vorkonditionierung in PBS nachgewiesen werden, was ebenfalls einen Versteifungseffekt durch Mineralisierung verschleiern könnte. Trotz der aufgetretenen Probleme wurden in dieser Arbeit wichtige methodische Weiterentwicklungen erarbeitet, wie z.B. die Verwendung von Glimmer für dieKalibrierung der Cantilever-Sensitivität, sowie eine iterative Methode zur Auswahl geeigneter Cantilever. Die ermittelten Zusammenhänge, sowie die methodischen Weiterentwicklungen werden insgesamt einen wertvollen Beitrag für zukünftige mechanische Untersuchungen an mineralisierten Kollagenfibrillen leisten.

Collagens are the most abundant and structurally the most important proteins of the human extracellular matrix. Therefore, the mechanical properties of the collagen building blocks, that are collagen fibrils in mineralized and non-mineralized form, are of crucial importance. In spite of their important role, the mineralization process of collagen fibrils in vitro as it relates to the mechanical properties has not been studied comprehensively. In this study, the mechanical properties of in vitro mineralized native and reconstituted collagen fibrils were investigated at different stages of mineralization using Atomic Force Microscopy (AFM) based nanoindentation. A measurement protocol was developed which allows the investigation of several fibrils within the same measurement run. First, native and reconstituted fibrils were selected and imaged using AFM in the contact mode. Second, fibrils were preconditioned in PBS buffer at 37 °C, for either 2h or 48h. Third, indentation force maps of the already selected fibrils were measured in contact mode in PBS at sample areas of 1 x 2 μm. Fourth, the mineralization process was initiated by adding a mineralization buffer and, fifth, force maps in contact mode were taken after 20h, 40h, and 60h of mineralization time. Per force map, 16 indentation points on the longitudinal axis and at least 10 indentation points on the crosssectional axis of the fibril were measured. A custom-built Matlab script was used for the analysis of the indentation data (depth, deflection, reaction force), and the calculated modulus. The mechanical properties of samples across the mineralization stages were compared. The results suggest that a sample of reconstituted fibrils could well resemble the mechanical properties of native fibrils, and even provide less variance among fibrils compared to native samples. As a result of the mineralization procedure, crystal formation was detected on the fibrils in all samples. The presence of intrafibrillar mineralization was suggested by the results but could not be significantly verified. EDTA was successfully used after some mineralization steps to clear off surface crystallization, but may have also influenced intrafibrillar mineral deposits. It was found, that pre-conditioning in PBS significantly reduced the subsequent softening behavior, which may partially suppress the stiffening effect of mineralization. Additionally, important methodological developments emerged from the study, such as the use of a mica disc for the sensitivity calibration of the AFM, as well as an iterative method for the choice of the cantilever. Overall, the use of AFM nanoindentation with a sharp pyramidal tip proved to impose frequent complications when measuring mineralized fibrils. Tensile tests might be a more promising alternative in future studies.