Novel structural probes for glycomics

Abstract

Neuere Untersuchungen haben gezeigt, dass die Glykosylierung von Proteinen und Lipiden, die mit häufigste und strukturell komplexeste post-translationale Modifikation, einen Schlüssel-schritt bei der Kommunikation zwischen Zellen und der Wechselwirkung von Zellen mit Pathogenen darstellt.<br />In diesem Zusammenhang hat sich die Glykomik, die Untersuchung des Glykoms, also der Gesamtheit an Glykanen in einem betrachteten Rahmen - oft eine Zellumgebung, ein Gewebe oder ein Organismus - zu einer Schlüsseltechnologie in der Medizindiagnostik entwickelt. Die Herstellung von Zusammenhängen zwischen der Änderung des Glykosilierungsmusters im Sinne von objektiv bestimmbaren Glykanindikatoren und die Bestimmung von Struktur und Vernetzung von Glykanbausteinen verspricht einen "Fingerabdruck" eines Krankheitsbilds zu liefern und damit der Medizindiagnostik neue, verbesserte Verfahren bei der Erkennung, Verfolgung und Behandlung von Krankheiten anbieten zu können. Um die Glykosilierung und die Vielfalt an Glykanen verfolgen zu können bedarf es einer Methode zur exakten analytischen Quantifizierung der Komponenten. Während die Entwicklung in der Auftrennung und Detektion von biogenen Proben in den letzten Jahren bedeutende Fortschritte gemacht hat, mangelt es noch immer an einer zufriedenstellenden Derivatisierungs¬methode für Glykane, besonders im Sinne eines quantitativen Analysenverfahrens.<br />Das Ziel meiner Doktorarbeit war dementsprechend a) Konzeption und Darstellung eines multifunktionellen Reagens zur vergleichenden Glykananalyse auf der Basis einer Derivatisie-rung des Glykanensembles mittels differentieller Isotopenmarkierung. Merkmale des angestreb¬ten Verfahrens sind ein rascher, annähernd vollständiger Reaktandenumsatz und Ausbildung einer kovalenten Bindung zum Glykan. Das Verfahren ist, entsprechend den Reaktionspara¬metern bei ca. Umgebungstemperatur und in verdünnter wässriger Lösung , durch experimen¬telle Einfachheit und ausgesprochene Eignung zum Einsatz im Rahmen von durchsatzintensiver Benutzung gekennzeichnet. Die Entwicklung und Erprobung von neuen Reagenzien zur Glykan¬derivatiserung sollte weiters b) die Verbindung zu einer multifunktionel-len Molekülbaustein ermöglichen, der unter anderem die Einführung einer differentieller Isotopenmarkierung, eines syn-diols zur erleichterten Auftrennung und eines Fluorophors zur Erniedrigung der Nachweisgrenze der derivatisierten Glykane erlaubt.<br />

Studies in recent years have clarified that the glycosylation of proteins and lipids, the most abundant and arguably most structurally complex post-translational modification, is of pivotal importance in cellular signaling and cell-pathogen interactions. In this context, glycomics, the comprehensive study of the glycome, that is, the set of glycans within a given reference framework - often cell, tissue or entire organism - has evolved at the forefront of medicinal diagnostics: Profiling changes in glycosylation, thus elucidating structure and function of objectively measurable, characteristic glycan indicators ("biomarkers") may allow for a "fingerprint" assessment of cellular phenotype, metabolic state, cell development stage a.s.f., thus endow medicine with a probe for the discernment of disease states ranging from prediction and early detection to diagnosis and therapy response.<br />A profound understanding of the biological roles of glycosylation states requires quantitative glycan analysis. While the progress in techniques dealing with separation and analysis of biogenic samples has been considerable, glycan derivatization protocols have lagged behind: In particular, a rigorously quantitative protocol of analysis has not yet been reported.<br />The aim of my thesis was a) to design and synthesize a multifunctional reagent for enhanced comparative glycan analysis via differential isotope-tagging that would allow for rapid virtually complete glycan derivatization via formation of a covalent linkage to the glycotarget.<br />The desired protocol was specified to aim for high-throughput amenability and experimental straightforwardness, achieving irreversible derivatization of the glycan target ensemble at around room temperature in about neutral aqueous media. Development and evaluation of novel means of glycan derivatization would then b) allow for the link of a functional "tag" to the derivatization reagent, the tag featuring inter alia a differential stable isotope tagging motif, moreover a syn-diol label and a fluorophore for enhanced sepration and sensitivity of detection, respectively.