A microfluidic chip for single droplet manipulation and analysis by Raman microspectroscopy

Abstract

Diese Diplomarbeit zeigt den Designprozess und die Umsetzung eines mikrofluidischen Chips, womit einzelne Mikrotropfen erzeugt, manipuliert und mittels Raman-Spektroskopie analysiert werden können.<br />Ein Tropfen stellt dabei einen geschlossenen Raum dar, in welchem Reaktionen stattfinden oder Spezies isoliert werden können und nur kleinste Mengen an Probenvolumen notwendig sind. Eine Möglichkeit diese Mikroreaktionskammern zu vermessen ist Raman-Spektroskopie, welche qualitative wie quantitative Studien auf molekularer Ebene ermöglicht, wobei nur minimale oder gar keine Probenaufbereitung notwendig ist. Da der Raman-Effekt relativ schwach ist, wird das Raman-Signal über mehrere Sekunden akkumuliert, was erfordert, dass der Tropfen ruhig und stabil an einer genauen Position gehalten werden muss.<br /> Um das zu erreichen, wird ein gequetschter Mikrotropfen durch Vertiefungen im Kanal geführt und an einem Ankerpunkt eingefangen.<br />Mittels numerischer Strömungsmechanik-Simulation wird das Verhalten des Chips abgeschätzt und eine Optimierung des Chipdesigns ermöglicht. Ein stark wasserabweisendes Silikon wird als Kanalstruktur verwendet, um die Handhabung der Tropfen zu verbessern. Der Kanal wird schließlich mit einem 170 mikrometer dünnen Borosilikatglas dauerhaft versiegelt, welches aufgrund seiner sehr guten optischen Eigenschaften die Verluste des Ramansignals minimiert. Der Chip wird in Hinblick auf Tropfenbildung und Ankerkraft getestet, indem gequetschte Wassertropfen mit verschiedenen Durchmessern und Erzeugungsraten in einer Ölphase gebildet werden. Dabei zeigen sich zwei unterschiedliche Möglichkeiten, um diese stabil und definiert am Ankerpunkt einzufangen. Zur Demonstration der Leistungsfähigkeit wird eine Enzymreaktion untersucht und die Verläufe von Substrat und Reaktionsprodukt über die Zeit mittels Raman-Spektroskopie aufgezeichnet. Um die Enzymkinetik zu erfassen, wird die Messung für fünf verschiedene Substratkonzentrationen, aber gleichbleibender Enzymkonzentration wiederholt. Die Ergebnisse werden in einer Verlaufskurve dargestellt, aus der sich die Anfangsgeschwindigkeit der jeweiligen Reaktion berechnen lässt. Die erhaltenen Resultate der unterschiedlichen Messungen werden abschließend linearisiert in einem Lineweaver-Burk-Diagramm dargestellt, woraus sich die Michaeliskonstante Km und die maximale Reaktionsgeschwindigkeit Vmax ablesen lassen.<br /> Die vorgelegte Arbeit zeigt als Erste die Möglichkeit auf, einen einzelnen, mikrofluidisch erzeugten und anschließend eingefangenen Tropfen mittels Raman-Spektroskopie zu analysieren.<br />

In this thesis the design and realization of a microfluidic chip for single droplet creation, manipulation and analysis by means of Raman microspectroscopy is presented. Every single droplet represents a micro-compartment where reactions can occur or species can be isolated, while only a small sample volume is needed. Raman spectroscopy is applied for the analysis of these individual micro-reaction-chambers, which permits qualitative and quantitative studies at molecular level with minimal or no sample preparation necessary. The Raman effect is comparatively weak, therefore, measurements are carried out over several seconds to accumulate the scattered photons and increase the signal intensity.<br /> To facilitate single droplet evaluation, the micro-compartment has to remain stable at a precise position. A passive rail and anchor structure is designed, allowing to guide and trap squeezed droplets inside a microchannel. To evaluate the behavior of the devices and optimize the chip design, numerical simulations are performed. The chip is fabricated, using a highly hydrophobic silicone as channel material to improve the formation of aqueous microdroplets. Channels are sealed with a 170 micrometer thin borosilicate glass to minimize losses of Raman signal. The chip's functionality is tested by creating squeezed water in oil microemulsions at various diameters and rates, showing two different droplet capturing modes. To demonstrate the chip's capability, an enzyme-catalyzed reaction is investigated, using Raman spectroscopy to determine changes in concentrations of substrate and reaction product over time. Measurements are carried out for five different substrate concentrations, while keeping the enzyme concentration constant, to specify the enzyme kinetics. The progress curve of each measurement is calculated to obtain the initial velocity of the reaction. Results are plotted in a Lineweaver-Burk plot and the kinetics, represented by the Michaelis constant Km and maximum velocity Vmax, are evaluated This is the first time that a microfluidic chip is utilized to analyze a single, captured droplet by Raman microspectroscopy.<br />