Vergleichende Studie zur elektrischen Charakerisierung von Zellkulturen von Typ CaCo-2

Abstract

Für die Entwicklung von Medikamenten und für die Untersuchungen deren Wirkungsweise auf den lebenden Organismus sind in-vitro Tests ein wichtiges Testinstrument. Durch Bioimpedanzmessungen kann der Prozess des Testens vereinfacht und beschleunigt werden. Ein wesentlicher Aspekt dieser Messungen ist die Reproduzierbarkeit, um korrekte Ergebnisse zu gewährleisten. Die vorliegende Arbeit konzentriert sich auf elektrische Messungen an Darmkrebszellen (CaCo-2). Dazu wurden in einem transepithelialen Messaufbau Zellschichten mit der Vierpunktmessmethode charakterisiert.<br />Die Suche nach den Verbesserungspotentialen im Messaufbau, welche die Reproduzierbarkeit der Impedanzmessungen beeinflussen, ist ein wesentliches Thema dieser Arbeit. Für die Durchführung zeitlich ausgedehnter Messungen wurde die Langzeitverwendung von Mikroelektroden untersucht.<br />Mit einer Vierpunktmessung wurde in Intervallen von 30 Minuten der Impedanzverlauf über das gesamte Wachstum, abhängig von der Frequenz, für eine Dauer von 14 Tagen aufgezeichnet. Es wurden die Fehlerquellen, welche zu inkorrekten Messergebnissen geführt haben, identifiziert. Bedingt durch die Position der Topelektroden ändert sich die Feldverteilung zwischen oberen und unteren Elektrodenpaaren. Diese Effekte der Feldverteilung wurden, mit dem Solartron 1260 FRA untersucht. Die Feldverteilung welche sich durch Positionierung der Topelektroden verändert, bedingt eine signifikante Veränderung der Impedanzwerte. Es wurden positionsbedingte Abweichungen von durchschnittlich 12% über das komplette Messspektrum gemessen. Bei repetitiven Messungen mit dem selben Messaufbau und identer Elektrodengeometrie beträgt diese Abweichung unter 2,5% über den gesamten Frequenzbereich. Der Einfluss des Modus des Medientauschs (manuell und mikrofluidikunterstützt) wurde ebenfalls getestet.<br />Manueller Flüssigkeitstausch führt zu einer relativen Standardabweichung der Impedanz von durchschnittlich 16-25%, während diese bei mikrofluidischem Medientausch im Bereich bis 20 kHz unter 10% des Impedanzwertes bleibt. Im Rahmen dieser Arbeit wurde auch festgestellt, dass das Hioki 3522-20 LCR Meter bei Bioimpedanzmessungen Impedanzsprünge bei 100 Hz und 1100 Hz aufweist. Durch Verwendung der Agilent E4980a LCR Meters oder der Solartron 1260 kann die Frequenzbandbreite in der Messungen an biologischen Proben möglich sind, deutlich erweitert werden.<br />

For the development of drugs and their effects on the living organism, in-vitro tests represent an important testing method. The process can be simplified and accelerated by using bio-impedance measurements.<br />To assure correct results, the reproducibility of the tests is essential. Therefore, this Thesis focuses on the electrical measurement of bowel cancer cells (CaCo-2). In order to characterize the cell-layers of the transepithelial measurement setup, the four-point method was used. Another major focus of this Thesis is the examination of improvement points in the measurement setup in order to accomplish better reproducibility. For the execution of prolonged measurements the long-term use of microelectrodes was investigated. Using the four-point method in 30 min time intervals the impedance progression was recorded in dependency of the frequency during the whole growth process lasting 14 days.<br />Inaccuracy sources which have led to incorrect results have been identified. The alteration of the field distribution between the upper and lower electrode-pairs, conditioned by the position of the top-electrodes has been analyzed using Solartron 1260 FRA.<br />This effect results in significant changes of the impedance values averaging in a difference of up to 12 % above the entire measuring-spectrum. With repetitive measurements, the same measuring setup and identical electrode-geometries an average difference of 2.5 % can be achieved. Additionally, the influence of the exchange of medium was examined and it was determined that manual fluid-exchange lead to a relative standard-deviation of the impedance of averagely 16 to 25 %, whereas microfluidic-aided exchange in a frequency range up to 20 kHz remained under 10 %.<br />Furthermore, cracks in the impedance measurements at 100 Hz and 1100 Hz using the Hioki 3522-20 LCR2 meter have been detected. With Agilent E4980a LCR meter or the Solartron 1260 a considerably broader frequency range could be reached.