Optofluidic techniques for microflow cytometry

Abstract

Die Ermittlung intrinsischer Parameter biologischer Zellen mittels optischer Messverfahren stellt ein wichtiges Forschungsgebiet der modernen Biotechnologie dar. Die Entwicklung kompakter bioanalytischer Systeme erfordert eine enge interdisziplinäre Verknüpfung der Bereiche Biologie und Technik und die Berücksichtigung einiger wichtiger Aspekte im Hinblick auf eine erfolgreiche Realisierung: geringe Probenvolumina, preiswerte Herstellung und analytische Effizienz. Miniaturisierte Systeme besitzen das Potential, diese Anforderungen hervorragend zu erfüllen. Gegenstand dieser Dissertation ist die Realisierung und Bewertung optofluidischer Elemente zur Verbesserung der analytischen Kapazität integrierter Durchflusszytometer. Nach computerbasierten Simulationen der fluiddynamischen und optischen Zustände des Systems wurden zur Demonstration der Funktionalität mikrostrukturierte Prototypen realisiert. Die Durchführung umfangreicher Experimente mit biologischen Proben und Mikropartikel-Standards erlaubte eine technische Evaluierung der integrierten Sensorsysteme. Diese wissenschaftliche Studie untersucht zwei Fertigungsmethoden, Mikrostereolithografie und Femtosekunden-Laserablation, welche sich hervorragend zur schnellen und hochwertigen Fertigung mikrofluidischer Designs eignen. Ein miniaturisiertes Durchflusszytometer, basierend auf preiswerten, standardisierten optischen Komponenten mit der Möglichkeit zur dreidimensionalen hydrodynamischen Probenfokussierung, wurde entwickelt.<br />Analytische Messungen des axialen Lichtverlusts und der Fluoreszenz einzelner Zellen erlauben eine zuverlässige Klassifizierung. Die Manipulation von Flüssigkeiten und Licht auf Mikrostrukturebene, auch definiert als Optofluidik, ermöglicht die Kombination analytischer Mikrosysteme mit adaptierbaren mikrophotonischen Elementen. Zum einen wurde ein planarer Chip für die variable Konfiguration der multikonvexen Form einer Flüssiglinse mittels Veränderung der Flussratenverhältnisse entwickelt. Zum anderen werden die Funktionsweisen zweier dynamischer Flüssiglichtwellenleiter zur Positions- und Richtungsmodifikation demonstriert. Diese optofluidischen Eigenschaften haben sich als vorteilhaft für die Applikation von anpassbaren optischen Elementen auf einen mikrostrukturierten Chip erwiesen. Den Abschluss bildet ein miniaturisiertes Durchflusszytometersystem, kombiniert mit einer abstimmbaren Flüssiglinse. Sowohl Partikelsuspensionen als auch biologische Zellproben wurden untersucht und mit Erfolg klassifiziert, wodurch die gesteigerte analytische Kapazität des Mikrosystems bestätigt wurde. Durch die Kombination von einerseits hochentwickelten optofluidischen Systemen und andererseits einfachen Herstellungsmethoden besteht die Möglichkeit, konkurrenzfähige Alternativen zu klassisch analytischen Geräten zu entwickeln und diagnostische Tests zu verbessern. Die erzielten Resultate dieser Arbeit zeigen verschiedene Lösungsmöglichkeiten zur Überwindung gegenwärtiger Herausforderungen in den Bereichen Optofluidik, Rapid Prototyping und der modernen Biotechnologie.<br />

Single cell analysis is an exciting field of today's research.<br />The development and introduction of bioanalytical systems includes challenging tasks of multiple disciplines from biology via physics to engineering in consideration of a few key aspects: small sample volumes, inexpensive consumable devices, and high analytical performance.<br />Miniaturized total analysis systems are highly promising to fulfill these requirements. The main theme of this PhD thesis is the integration of optofluidic elements to improve the measurement performance of optical single cell analysis devices. Functional unique ideas are transformed into proof-of-principle prototypes, after simulating the fluidic/optical behavior of these devices. Experiments with biological samples and particle standards are conducted to evaluate the microstructured sensor system. In this study, two rapid prototyping methods (micro-stereolithography, femtosecond-pulsed laser ablation) have been utilized enabling a fast realization of microfluidic designs.<br />First, an optical microflow cytometer has been realized with 3D hydrodynamic sample focusing and a high quality detection method based on integrated technologies. Analytical measurements of the axial light loss and fluorescence of microbeads and biological cell populations allowed a classification based on intrinsic parameters resulting in a highly practical and effective detection system. In optofluidics, the manipulation of fluids and light at micrometer scale provides the opportunity to incorporate analytical microfluidic systems and tunable microphotonic elements. An optofluidic planar single-layer device with the ability to focus light three-dimensionally is presented. It allows a variable reconfiguration of the multiconvex shape of a microlens by adjusting the inlet flow rates. Additionally, two adaptable liquid-core/liquid-cladding waveguide designs are demonstrated with the possibility to adjust light path and direction. These optofluidic features have proven beneficial for the realization of advanced on-chip elements with the ability to integrate adjustability at the micrometer scale. In a concluding design, an adjustable optofluidic lens is integrated in the functional optical path of a microflow cytometer.<br />Several biological characterization measurements, investigating the axial light loss signal, are conducted to demonstrate the increased analytical performance of the microsystem. The application of advanced, adjustable optofluidic systems with inexpensive detection methods based on integrated technologies and the utilization of straightforward single-layer fabrication techniques provide the potential to compete with classical equipment and improve diagnostic tests. The results presented in this thesis may provide the tools and methods to help overcoming present challenges in optofluidics, flow cytometry, and rapid prototyping.