Investigating plasma membrane nanostructures with single molecule microscopy

Abstract

Einzelmolekül-Lokalisationsmikroskopie (Single Molecule Localization Microscopy, SMLM) beruht auf der Möglichkeit, einzelne Farbstoffmoleküle mit einer Genauigkeit weit unterhalb des optischen Beugungslimits zu lokalisieren. Die grundlegende Idee besteht darin, das stochastische Umschalten von Fluoreszenzmarkierungen zwischen einem dunklen und einem hellen Zustand auszunutzen. Die Messkonditionen werden so eingestellt, dass sich zu jedem beliebigen Zeitpunkt nur eine kleine Teilmenge von Fluoreszenzmarkierungen in einem hellen Zustand befindet. Dies gewährleistet eine ausreichende Trennung der einzelnen Fluoreszenzsignale für die Lokalisierung einzelner Molekülpositionen. Typischerweise werden mehrere tausend Bilder aufgenommen, um aus den ermittelten Molekülpositionen hochauflösende Lokalisierungskarten zu rekonstruieren. Frühe Anwendungen von SMLM führten zu der Annahme, dass praktisch alle Membranproteine in Clustern organisiert sind. In jüngster Zeit jedoch schürte die Beobachtung, dass praktisch alle Fluoreszenzmarker ein komplexes Blinkverhalten, einschließlich langlebiger Dunkelzustände, zeigen, Bedenken über die Existenz von Nanoclustern. Dies führt zur wiederholten Beobachtung einzelner Fluoreszenzmarker und damit zu Lokalisierungsclustern, welche sich nur schwer von molekularem Nanoclustering unterscheiden lassen.Für diese Arbeit habe ich zwei neue experimentelle Methoden entwickelt, um molekulares Nanoclustering von solchen Überzählungsartefakten zu unterscheiden. Als erstere nutzt Titrationsmikroskopie (Label Titration Microscopy) die charakteristischen Veränderungen von Lokalisierungskarten bei Variation der Markierungsdichte, um molekulares Nanoclustering zu erkennen. Ich wandte diese Methode zur Charakterisierung wichtiger Signalproteine in der Plasmamembran von T-Zellen an, von denen zuvor berichtet wurde, dass sie Nanoclustering zeigen, insbesondere der TCR und Lck. Darüber hinaus entwickelte ich einen alternativen Ansatz für die qualitative Beurteilung von molekularem Nanoclustering auf der Grundlage von 2-Farben-SMLM und eines Signifikanztest-Algorithmus.SMLM ist inherent auf Anwendungen in statischen Systemen (z.B. fixierte Zellen) beschränkt, was die Untersuchung der dynamischen Prozesse in der Plasmamembran lebender Zellen erschwert. Die Kombination von Protein-Mikrostrukturierung (Protein Micropatterning) mit Einzelpartikelverfolgung (Single Particle Tracking, SPT) liefert einen komplementären experimentellen Ansatz zur Untersuchung molekularer Wechselwirkungen ausgewählter Plasmamembranbestandteile in lebenden Zellen. Zusätzlich zu meiner experimentellen Arbeit mit SMLM verwendete ich umfangreiche Monte-Carlo-Simulationen, um theoretische Modelle für den Einfluss immobilisierter und angereicherter Membran-Nanostrukturen auf die Verteilung und Mobilität fluoreszenzmarkierter Tracermoleküle in solchen Mikrostrukturierungsexperimenten abzuleiten.

Single molecule localization microscopy (SMLM) relies on the possibility to localize single dye molecules with an accuracy far below the optical diffraction limit. The key idea is to exploit stochastic switching of fluorescent labels between a dark and a bright state. Imaging conditions are adjusted such that only a sparse subset of fluorescent labels is in a bright state at any given point in time. This ensures sufficient separation of individual fluorescent signals to allow for the localization of single molecule positions. Typically, many thousand images are recorded, and high-resolution localization maps are reconstructed from the determined molecular positions. Early applications of SMLM have led to the believe that virtually all membrane proteins are organized in clusters. Recently, however, concerns about the existence of nanoclusters have been fueled by the observation that virtually all fluorescent labels show complex blinking behavior including long-lived dark states. This leads to overcounting due to repeated observation of individual fluorescent labels, resulting in localization clusters which are difficult to discriminate from molecular clustering.For this thesis, I developed two novel experimental methods to differentiate molecular nanoclustering from overcounting artifacts. First, label titration microscopy makes use of the characteristic changes in the localization maps upon variation of label density to detect molecular nanoclustering. I applied this method for the characterization of key signaling proteins at the plasma membrane of T-cells, which have previously been reported to show nanoclustering, particularly the TCR and Lck. Further, I developed an alternative approach for the qualitative assessment of molecular nanoclustering based on 2-color SMLM and a significance testing algorithm.SMLM is inherently limited to applications in static systems (e.g. fixed cells) making it difficult to investigate the dynamic processes in the live cell plasma membrane. Combining protein micropatterning with single particle tracking (SPT) offers a complementary experimental approach to study molecular interactions of selected plasma membrane constituents in live cells. In addition to my experimental work on SMLM, I employed extensive Monte Carlo simulations to derive theoretical models for the influence of immobilized and enriched membrane nanofeatures on the distribution and mobility of fluorescently labelled tracer molecules in micropatterning experiments.