Two-photon initiators and macromers for biomedical applications

Abstract

Der 3D Druck und besonders der Einsatz von Photopolymeren für die Geweberekonstruktion sind heutzutage von außerordentlicher Bedeutung für die Biomedizin. Bei der klassischen UV-Polymerisation wird hochenergetisches, kurzwelliges Licht angewandt, wobei es durch Absorption von biologischem Gewebe zur Schädigung von Zellen sowie Verbrennungen der Matrix kommen kann. Zwei-Photonen Polymerisation basiert auf der Technologie von gepulsten, fokussierten Infrarotlasern und ermöglicht aufgrund der Transparenz von biologischem Gewebe gegenüber dem eingesetzten Infrarotlicht, die Herstellung hoch aufgelöster, komplexer drei dimensionaler Strukturen mit einer minimalinvasiven Technik. Hierfür sind wasserlösliche Matrixkomponenten unabdingbar (Monomere sowie Photoinitiatoren), um natürliches Gewebe bestmöglich nachzubilden. Nicht nur die Wasserlöslichkeit, sondern auch ein hohes Maß an Biokompatibilität aller Matrixkomponenten sind für eine effiziente Zwei-Photonen Polymerisation in Gegenwart von Zellen unerlässlich. Außerdem kann es aufgrund von angeregten Zuständen der Photoinitiatoren und der Bildung von reaktiven Sauerstoffspezies zu erheblichem Schaden des umgebenden Gewebes kommen.Um diese Limitierungen zu reduzieren, befasst sich diese Arbeit mit der gezielten Entwicklung spaltbarer Photoinitiatoren. Getrieben durch die Freisetzung von Kohlenstoffdioxid bzw. Stickstoff können spaltbare funktionelle Gruppen die Bildung von reaktiven Sauerstoffspezies reduzieren und somit zu einer vielversprechenden Biokompatibilität beitragen. Nebst Photoinitiatoren werden in dieser Arbeit auch Makromere weiterentwickelt, die auf einem natürlich vorkommenden Polysaccharid basieren (Hyaluronsäure), um natürliches Gewebe in Form von Hydrogelen optimal nachzubilden. Im Gegensatz zu den bisherig entwickelten Photoinitiatoren, konnten zwei Klassen an spaltbaren Photoinitiatoren synthetisiert werden. Die erste Klasse an Photoinitiatoren wurde über die gezielte Einbindung spaltbarer Oximester Gruppen in bereits etablierte Zykloketon-Kernstrukturen erhalten und die zweite Klasse über die Einführung spaltbarer Azosulfonat Gruppen in einen kommerziell erhältlichen Azofarbstoff. Die Spaltbarkeit der Photoinitiatoren wurde mithilfe von Photoreaktor-studien überprüft, wobei vor allem auf die Fotoprodukte der Stilben-basierten Azosulfonate eingegangen wurde, die als Konkurrenz-reaktion eine außerordentliche Tendenz zur Photoisomerisierung aufweisen. Die Wirksamkeit beider Photoinitiator-klassen wurde mittels Zwei-Photonen Lithographie in Gelatine-basierten Makromeren bestätigt. Hierbei wurde vor allem der Schwellenwert der Polymerisation von Azosulfonaten bei verschiedenen Wellenlängen ermittelt. Zusätzlich konnte durch Stammzellenstudien eine hohe Biokompatibilität der Azosulfonate bewiesen werden. Die Makromere basierend auf Hyaluronsäure konnten sogar dafür verwendet werden, um in Gegenwart von Zellen komplexe 3D Hydrogele zu drucken. Demnach wurde die Entwicklung und Anwendung neuer Zwei-Photonen Initiatoren über die Inkorporation spaltbarer Funktionalitäten (Oximester, Azosulfonate) erfolgreich durchgeführt. Außerdem wurde Hyaluronsäure als hervorragende Basiskomponente für die Entwicklung von Hydrogelstrukturen bestätigt, sofern das Molekulargewicht der Wiederholungseinheit niedrig gehalten wird, um die Löslichkeit der Makromere zu bewahren.

Three-dimensional printing and photopolymerization are powerful technologies for the reconstruction of tissue-like functional materials with great relevance for biomedicine. However, conventional high-energy lithographic techniques (UV-polymerization) exhibit considerable limitations, since the provided energy may induce collateral tissue damage along the irradiation pathway. The development of two-photon polymerization enabled the fabrication of hydrogel scaffolds with exceptional resolution, providing enough energy within the focal volume of a focused infrared laser to efficiently induce two-photon polymerization. The water-solubility of the matrix materials (monomers and photoinitiators) are of major importance for the reconstruction of tissue-like hydrogel scaffolds. Furthermore, the solubility in aqueous media and the biocompatibility of the compounds is essential for efficient two-photon polymerization in the presence of cells. Not only the compounds itself, but also the generation of reactive oxygen species, as a consequence of photoexcitation, are limiting factors regarding biocompatibility.The reduction of those limitations is targeted via a straightforward design of novel two-photon initiators and the association of cleavable moieties into pi-conjugated chromophores. The photolabile moieties could possibly reduce the formation of reactive oxygen species, due to their efficient dissociation mechanisms, while preserving biocompatibility. Furthermore, hyaluronic acid is investigated as endogenous substance for the development of hydrogel materials for tissue engineering. Two basic approaches were followed to synthesize cleavable two-photon initiators. On the one hand, photolabile oxime ester moieties were introduced into a well-established cycloketone core structure. On the other hand, photolabile azosulfonate moieties were incorporated into a commercially available azo dye. The photochemical behavior of the synthesized compounds was examined during comprehensive photoreactor studies, while focus was placed on the stilbene-based reference materials, which exhibited severe tendency towards photoisomerization. The efficiency of the novel two-photon initiators was confirmed via two-photon structuring tests in gelatin-based hydrogel formulations and the performance was compared to state-of the art initiators. Especially, the polymerization threshold of the azosulfonate-based two-photon initiators was studied in detail, since exceptionally stable hydrogel materials were obtained at various technically relevant femtosecond-laser wavelengths. Biocompatibility assays on various cell-lines proved their promising cytocompatibility. Finally, hyaluronic acid-based hydrogel formulations were successfully applied as material platform for three-dimensional cell encapsulation using two-photon polymerization. Summarizing, the association of photolabile groups (oxime esters, azosulfonates) to pi-conjugated chromophores was successful. Furthermore, hyaluronic acid was confirmed as promising candidate for the fabrication of tissue-like hydrogel materials as long as the molecular weight is kept moderate to ensure solubility in aqueous media.