Improvements and applications of quantitative single molecule localization microscopy

Abstract

Die Einzelmoleküllokalisierungsmikroskopie (single molecule localization microscopy, SMLM) umfasst eine Gruppe von stochastischen photo-schaltenden hochauflösenden Mikroskopie Methoden, z.B. PALM und STORM, bei denen Einzelmolekülpositionen mit Hilfe von Algorithmen lokalisiert werden. Eine ausreichend geringe Dichte nicht überlappender, zufällig aktiver Fluorophore wird abgebildet, um ihre Sub-Pixel-Position zu bestimmen und ein hochauflösendes Bild aus Tausenden von Bildern zu rekonstruieren. Die Lokalisierung von Einzelmolekülsignalen ermöglicht es SMLM, die Auflösungsgrenze zu durchbrechen und Einzelmolekülzentren mit einer Genauigkeit von unter 20 nm zu lokalisieren. In den vier Beiträgen dieser Arbeit habe ich SMLM und fortgeschrittene Algorithmen angewandt, um die Morphologie subzellulärer Strukturen und die räumliche Verteilung von Proteinen zu analysieren: Erstens wurde SMLM eingesetzt, um das Aktinzytoskelett von Thrombozyten in verschiedenen morphologischen Zuständen zu beobachten. Verbesserte Bildgebungspuffer ermöglichten Lokalisierungsgenauigkeiten von bis zu 12 nm. Zweitens haben wir eine Software für die vergleichende Analyse von Proteinverteilungen in einem künstlichen Modell eines Blutgerinnsels entwickelt. Die auf 3D SMLM basierende Datenanalyseplattform bestätigte die unterschiedliche Verteilung von CD41 und CD62P. Drittens verbesserte ich den Echtzeit-3D-SMLM-Lokalisierungsalgorithmus durch die Kombination der least-square Methode mit Vorlagenbildern von Einzelmolekülen. In einem letzten Beitrag habe ich eine Plattform entwickelt, die Mikrofluidik, Zweifarben-3D-SMLM und fortschrittliche Algorithmen kombiniert, um die Thrombozytenaktivierung in einem Blutgefäßchip zu untersuchen. Wir konnten eine Verbindung zwischen aktivierten Thrombozyten und gestressten Endothelzellen nachweisen, die durch maschinelles Lernen und die Analyse der mitochondrialen Morphologie ermittelt wurde. Ich habe gezeigt, dass SMLM mit fortschrittlichen Algorithmen eine detailliertere Analyse subzellulärer Prozesse, zellulärer Strukturen und der Proteinverteilung auf Nanometerebene ermöglicht. Automatisierung, Echtzeitanalyse und verbesserte Bildpuffer erhöhten die für eine präzise Nachbearbeitung erforderliche Bildqualität. Die simultane Zweifarben-SMLM hat ihren Nutzen bei der Verknüpfung von Proteinverteilungen im Nanobereich mit makroskopischen subzellulären Strukturen bewiesen.

Single molecule localization microscopy (SMLM) covers a group of stochastic photo-switching microscopy methods for example PALM, and STORM, in which fluorescent signals are localized using fitting algorithms. A sufficiently low density of non-overlapping, randomly active fluorophores are imaged to determine their sub-pixel position and reconstruct a super-resolved image from thousands of images. Localization of single molecule signals allows SMLM to break the resolution limit and localize emitter centres with sub 20 nm precision. In the four contributions included in this thesis, I applied SMLM and advanced algorithms to analyse morphology of subcellular structures and spatial distribution of proteins: Firstly, SMLM was applied to observe the actin cytoskeleton of platelets at different morphological states. Improved imaging buffers allowed localisation accuracies of up to 12 nm. Secondly, we developed a software for comparative analysis of protein distributions in an artificial clot model. 3D SMLM based data analysis platform confirmed different distribution of CD41 and CD62P. Thirdly, I improved real-time 3D SMLM localization algorithm by combining the least-square approach with template images. In a final contribution, I developed a platform combing microfluidics, two-colour 3D SMLM and advanced algorithms to study platelet activation in a blood vessel chip. We showed a link between activated platelets and stressed endothelial cells determined via machine learning assisted mitochondrial morphology analysis. I demonstrated that SMLM with advanced algorithms enable a more detailed analysis of subcellular processes, cellular structures, and protein distribution at a nanometre level. Automation, real-time analysis, and improved imaging buffers increased the image quality necessary for precise post-processing. Simultaneous two-colour SMLM has proven its utility in linking nanoscale protein distributions with macroscopic subcellular structures.