In-depth analysis of T cell receptor dynamics and intra-complex interactions

Abstract

Der T Zell Rezeptor (TCR) ist ein membrangebundener Proteinkomplex, der an der Aktivierung von T Zellen beteiligt ist. Antigene werden auf Histokompatibilitätskomplex-Molekülen (pMHC) präsentiert, welche sich auf der Membran von antigenpräsentierenden Zellen befinden. Die Erkennung von Antigenen durch den TCR führt zu einer Interaktion zwischen TCR und pMHC. Dieser Prozess kann von der Dynamik der beteiligten Membranproteine beeinflusst werden, weswegen die Diffusionsanalyse der Proteine eine wichtige Rolle für die Untersuchung der TCR-pMHC Interaktion spielt. Die geringe Mobilität des TCR (D ~ 0.05 µm²/s) kann die Effizienz der TCR-pMHC-Interaktion beeinträchtigen. Es ist zu überprüfen, ob die niedrige Mobilität für T Zellen charakteristisch ist oder ob sie aus externen Zellbehandlungen resultiert, die für mikroskopische Ansätze erforderlich sind. In dieser Arbeit wurden Einzel-Molekül-Tracking Experimente durchgeführt, um das Diffusionsverhalten des TCR unter verschiedenen experimentellen Bedingungen zu untersuchen. Tracking-Experimente wurden mit fluoreszenzmarkierten anti-TCRβ scFv-Fragmenten durchgeführt und es wurden drei verschiedene Adhäsionsflächen für T Zellen verglichen: (i) das Homopolymer Poly-D-Lysine, (ii) das Glykoprotein Fibronektin und (iii) eine Lipid-Doppelschicht die interzelluläre Zelladhäsionsmoleküle (ICAM-1) aufweist. Darüber hinaus wurde die HILO-Mikroskopie (Highly Inclined and Laminated Optical Sheet) verwendet, um die Diffusion auf der apikalen Membran mit den Ergebnissen der internen Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie (TIRF) auf der basalen T Zellmembran zu vergleichen. Um Einflüsse von Fluorophoren auf die Diffusion auszuschließen, wurden die scFv-Fragmente mit unterschiedlichen organischen Farbstoffen konjugiert und die Diffusionsergebnisse analysiert. Ähnliche Diffusionseigenschaften des TCR wurden auf allen drei beschichteten Oberflächen mit einer Diffusionskonstante D im Bereich von 0.03 – 0.06 µm²/s gemessen. Messungen mit verschiedenen Fluorophoren und auch die Verwendung von Vollantikörpern anstelle des scFv-Fragments führten zu ähnlichen Ergebnissen. Die TCR-Mobilität, die mittels HILO-Mikroskopie gemessen wurde, war mit jener mittels TIRF-Mikroskopie vergleichbar. Aus diesen Daten kann geschlossen werden, dass es keinen direkten Einfluss der Adhäsionsflächen auf die Mobilität des TCR gibt.

The T cell receptor (TCR) is the key membrane protein that participates in the activation of T cells in response to the recognition of antigens presented by the major histocompatibility complex (pMHC) on the membrane of antigen presenting cells. This binding process is likely to depend on the dynamics of the participating membrane proteins, making the analysis of their diffusion an important task for studying TCR–pMHC interaction. The previously described low mobility of the TCR (D ~ 0.05 µm²/s) might impair the efficiency of TCR-pMHC engagement, encouraging the task to verify if the slow mobility is indeed inherent to T cells or if it results from external cell treatments required for microscopy approaches. In this work, single molecule tracking experiments were performed to investigate to which degree the diffusion behavior of the TCR is affected by different experimental conditions. Tracking experiments were done using fluorescently labelled anti-TCRβ single chain fragments (scFV) derived from the monoclonal antibody H57. Three different strategies for presenting adhesive surfaces to T cells were compared: (i) the homo-polymer Poly-D-Lysine, (ii) the glycoprotein Fibronectin and (iii) a supported lipid bilayer presenting intercellular adhesion molecule 1 (ICAM-1). Furthermore, Highly Inclined and Laminated Optical Sheet (HILO) microscopy was utilized to compare the diffusion on the apical membrane to the results derived from Total Internal Reflection (TIR) imaging on the basal T cell membrane. To further exclude fluorophore influences on the diffusion measurements, scFV were conjugated to varying organic dyes and the diffusion results were compared. Similar diffusion characteristics of the TCR were found on all three coated surfaces, with D ranging from 0.03 – 0.06 µm²/s. Also, different fluorophores attached to the scFV or the usage of full antibodies instead of the single chain fragment yielded similar results. Furthermore, TCR mobility at the top membrane measured via HiLO microscopy was similar to the mobility at the bottom membrane measured via TIRF microscopy. From this data we conclude that there is no direct influence of the adhesive surfaces on the mobility of the TCR. In the second part of this work the interaction kinetics of the ζ- and TCRβ subunits of the TCR/CD3 complex were measured using different imaging modalities. Recent measurements have indicated discrepancies in the dynamic behavior of these components, reporting a faster diffusion for ζ. To address these findings, diffusion properties were obtained from single particle tracking experiments, and further investigated by combining in vivo micropatterning with Fluorescence Recovery after Photobleaching (FRAP). The diffusion analysis of the tracking measurements hints to a more mobile ζ-chain, highlighting the possibility of TCR/CD3-independent ζ within the T cell membrane. Evaluation of the signal recovery curve from the FRAP experiments indicates a stable interaction between TCR/CD3 subunits. While the FRAP results do not represent a more mobile ζ chain, they also do not exclude the existence of free membrane-bound ζ.