In-Situ Impedanzmessung an biologischen Caco-2 Zellen mit IDES Elektroden

Abstract

Für die Weiterentwicklung von Medikamenten in der Pharmazie werden einfache und schnelle Testmethoden zur Klärung des Medikamenteneinflusses (Aufnahme, Transport, Metabolismus) auf lebendes Gewebe benötigt. Die Wirkstoffe von oral verabreichten Medikamenten werden über den Verdauungstrakt durch den Körper aufgenommen. Für die Resorption der Wirkstoffe sind die Epithelschichten des Dünndarms entscheidend. Als Modell der Epithelschicht gelten die Caco-2 Zellen als eine anerkannte Zelllinie. Diese Zellen bilden eine planare Zellmonolage und dienen in der pharmazeutischen Wirkstoffforschung als Ersatz der Epithelschicht.<br />Als wichtiger Parameter dient die Dichte des Zelllayers. Zur Überwachung des Wachstums hat sich die elektrische Impedanzmessung während des Wachstumsprozess als zielführend herausgestellt. Um diese Impedanz zu messen, muss der Strom und die Spannung an dem "device under test" in diesem Fall der Zellschicht gemessen werden. Dies kann einerseits durch eine Zweipunktmessung, andererseits durch eine Vierpunktmessung geschehen. Die Zellkulturen werden in einzelnen, sogenannten "Töpfchen" herangezogen, wobei die Sensorfelder am Boden untergebracht sind. Bei der Zweipunktmessung kommt es durch den elektrischen Strom zur Bildung eines geladenen Bereiches an den Elektrodenkontaktflächen, der die gemessene Impedanz verfälscht. Als Verbesserung dient eine Vierpunktmessung. Für den Messaufbau werden zwei Elektroden für das Einprägen des Stromes und zwei weitere Elektroden für die stromlose, hochohmige Messung der Spannung verwendet. Durch die Stromfreiheit der Spannungsmesselektroden bilden sich keine geladenen Bereiche an den Elektroden aus.<br />Die Messung der Impedanz mit Sensorfeldern beruht auf der ionischen Leitfähigkeit der Zellsuspension und des kapazitiven Charakters der Zellmembran. Beim Wachstumsprozess verändern sich die Ionenkonzentration und der pH-Wert.<br />Um eine große Anzahl an Versuchen parallel durch führen zu können, wurde eine Anordnung mit mehreren Sensorfeldern auf einer Probenplatte vorgesehen. In dieser Arbeit wurden acht Sensorfelder mit jeweils einer 2 mal 4 Matrix auf einer Probenplatte angeordnet. Eine parallele Messung der biologischen Proben aller 8 Sensorfeldern ist durch ein automatisiertes Umschalten des Multifrequenz LCR-Meters zwischen den Sensorfeldern möglich.<br />Ziel der Arbeit war es, die Vierpunktmessung im Vergleich zur Zweipunktmessung zu evaluieren, sowie den Einfluss von Salzkonzentration und pH-Wert auf das Messergebnis zu überprüfen. Zuerst wurde der Einfluss des Mediums ohne Zellen auf die Impedanzmessung untersucht und der ideale Frequenzbereich für die Messung an Caco-2 Zellen gefunden. Es konnte für die zeitabhängige Impedanzmessung an Caco-2 Zellen eine deutliche Steigerung der Impedanz nachgewiesen werden.<br />

For efficient development of drugs in pharmaceutical industry, simple and fast methods of testing drug transport phenomena (capture, transport and metabolism) on living tissue have to be designed. Orally administered substances are absorbed via the digestive tract. For the absorption of the active ingredients, the epithelium of the small intestine is relevant. The Caco-2 cell is established as a model of the epithelium. These cells form a planar cell layer and serve, after a growth process, as a dense layer of cells for drug transport studies.<br />An important parameter for subsequent tests is the density of the cell layer. One reliable experimental procedure for measuring density is an impedance measurement. The impedance is calculated by measuring the voltage and the current at the device under test, i.e. the cell layer.<br />The possible measure systems are either a two-point measurement or a four-point measurement. The cell cultures are grown in separate pots with integrated sensor areas at the bottom. By measuring with the two-point measurement, current flows throw the electrodes and on this account, as a consequence, charged areas are formed at the electrode-electrolyte connection. The measured impedance is influenced by these charged areas. In order to eliminate the influence of charged areas, a four-point measurement with two current electrodes and two current less voltage electrodes is applied. At the intersections are no longer charged areas because of the high ohmic voltage measurement.<br />The measurement of the impedance at the sensor field is based on the ionic conductivity of the cell suspension and the capacitive nature of the cell membrane. The growth process changes the ion concentration and the pH-value.<br />In order to be able to carry out a large number of experiments simultanesously, a test arrangement with multiple sensor fields on a plate was designed. In this work, eight sensor fields were arranged as a 2 by 4 matrix on a sample plane. By automatic switching of multi-frequency LCR meter, a parallel measurement of biological samples of all eight sensors is possible.<br />The main task of this thesis was to evaluate the operating principle of the four-point measurement in contrast to the two-point measurement, as well as to examine the influence of salt concentration and pH value on the results of measurement. On the basis of testing of the medium without cells, the ideal frequency range for the measurement of Caco-2 cells could be established. The result is that, for the time-dependent impedance measurement of Caco-2 cells, a significant increase of impedance could be reported.