Design and Synthesis of Isotope-Labeled Amino Acids and Precursors for Protein NMR Characterization

Abstract

Die NMR-Spektroskopie ist heute eine der wichtigsten Methoden zur Untersuchung von Struktur, Dynamik und Interaktion von Proteinen in Lösung.[1] Um sowohl Sensitivität als auch die Signalauflösung von Protein-NMR Spektren zu erhöhen,wurden Methoden entwickelt, um stabile Isotope wie 2H, 13C und 15N in die Zielproteine einzubringen. Die Proteinmarkierung kann durch Zugabe von metabolischen Aminosäurevorläufern oder den isotopenmarkierten Aminosäuren selbst zum Wachstumsmedium des exprimierenden Systems erreicht werden.[2] Hauptsächlich wird E. coli als Expressionssystem zur Proteinproduktion verwendet. Alternativ werden auch Zellkulturen aus Säugetieren, Insekten oder Hefen als Expressionssysteme zur Herstellung isotopenmarkierter Proteine genutzt.Im ersten Teil der Arbeit wurde eine synthetische Route für N-α-Fmoc-O-(bisdimethylaminophosphono)-[3,5-13C2-2,6-D2]-L-tyrosine (Fmoc-pTyr) entwickelt. Das Verfahren basiert auf einer zuvor veröffentlichten Strategie zur Einführung eines isolierten13C-H Spin-Systems in aromatischen Ringen.[3] Diese Synthese wurde in der vorliegenden Arbeit um eine Negishi-Kreuzkupplungsreaktion [4] und einer anschließenden Phosphorylierung erweitert [5,6]. Damit können isotopenmarkierte Bausteine hergestellt werden, die zur Synthese von Phosphotyrosin Peptiden mittels Festphasenpeptidsynthese(SPPS) herangezogen werden können. Diese Peptide können dann im Anschluss durch NMR-spektroskopische Methoden Information über Protein-Protein Wechselwirkungen liefern.Zusätzlich wurden zwei metabolische Aminosäure-Vorstufen für Valin und Leucin,als auch Isoleucin nach literaturbekannter Vorschrift synthetisiert.[7]Schließlich wurde im letzten Teil der Arbeit eine Synthese eines Imidazolpyruvat Tautomeres erarbeitet, das die selektive Isotopenmarkierung von Histidin erlaubt.Die Imidazol Seitenkette dieser Aminosäure weist herausragende strukturelle Eigenschaften auf. Die Seitenkette tritt in zwei tautomeren Formen auf und spielt eine wesentliche Rolle in verschiedenen Proteinmechanismen und Enzymaktivitäten.[8]Es konnte in der Vergangenheit gezeigt werden, dass die Histidin-Transaminaseim Histidin-Abbauweg reversibel ist, und somit Imidazole-Pyruvat als Substrat akzeptiert.[9] Darauf basierend konnten wir davon ein neues Histidine Isotopolog synthetisieren, welches eine 15N-13C-15N Seitenkette enthält.Die Synthese der isotopenmarkierten Zielsubstanzen wurde unter Verwendungentsprechender nicht-isotopenmarkierten Verbindungen entwickelt und optimiert.Beide Verbindungen konnten markiert gergestellt werden.

NMR spectroscopy has developed into a versatile tool to investigate proteins’ structure,dynamics, and interaction in solution at an atomic resolution.[1] To increase the sensitivity and resolution of protein NMR, labeling methods to incorporate stableisotopes such as 2H, 13C and 15N into proteins have been developed and are constantly improved further. Protein labeling can be achieved by supplementingthe growth media of the host cell with either metabolic amino acid precursors orisotopically labeled amino acids.[2] Mainly, E. coli is the expression system of choice for protein production. Alternatively, mammalian cells, insect cells or yeast can beapplied to incorporate isotopically labeled amino acids into desired proteins.In the first part of the thesis, a synthetic route for N-α-Fmoc-O-(bis-dimethylaminophosphono)-[3,5-13C2-2,6-D2]-L-tyrosine (Fmoc-pTyr) has been developed. The procedure is based on a previously published synthetic strategy for introducing an isolated13C-H spin system into aromatic ring systems.[3] This concept was further expanded by a Negishi cross-coupling reaction[4], and a subsequent phosphorylation strategy[5,6]. The target Fmoc-pTyr building block can be applied in solid-phasepeptide synthesis (SPPS) with a subsequent chemical peptide ligation and allowsfor NMR analysis of pTyr-containing interaction partners.The second part of the thesis deals with the synthesis of two metabolic precursors for valine/leucine and isoleucine.[7]Finally, novel isotopologues of the imidazole pyruvate tautomer have been introduced as metabolic precursors for selective histidine labeling. The imidazole sidechain of histidine is highly abundant on protein interaction surfaces and plays anessential role in various enzyme mechanisms, such as catalytic triads.[8] Previously,we could show that His-transaminase is highly reversible and effectively acceptsimidazole-pyruvic acid as a substrate. Imidazole-pyruvic acid is the first intermediatein the minor histidine degradation pathway in E. coli.[9] Based on our previous results, we could now introduce an isotopologue of imidazole-pyruvic acid containinga 15N-13C-15N side-chain isotope pattern with low-cost sources of carbon-13(formaldehyde) and nitrogen-15 (ammonium chloride).Synthesis of Fmoc-pTyr and imidazole-pyruvic acid isotopologues have been developed and optimized using corresponding unlabeled compounds. Both target compounds were synthesized with reasonable yields and purity. They can be used in SPPS (Fmoc-pTyr) or cell-based protein overexpression (imidazole pyruvic acid),allowing for peptide or protein investigation using biomolecular NMR applications.