Bioorthogonal control of drug action : Synthesis of click-cleavable pyrrolobenzodiazepine dimer derivatives

Abstract

Over the past decades, multiple DNA alkylating agents based on the pyrrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepine (PBD) scaffold have undergone clinical evaluation as potential anticancer therapeutics, primarily as DNA-cross-linking PBD-dimers in antibody-drug conjugates (ADCs). So far, Zynlonta® is the only FDA-approved PBD-ADC for the treatment of diffuse large B-cell lymphoma, as other candidates were terminated due to indiscriminate high toxicity or severe off-target effects.This study paves the way to the concept of bioorthogonal turn-OFF of PBD dimer derivatives through the click-to-release approach using tetrazine antidotes to enable toxicity control. This method is envisioned to disable the PBD dimer’s DNA-cross-linking abilities through fast (seconds to minutes) and complete (>99%) cleavage of the dimer linkage, resulting in a drop in toxicity from the picomolar IC50-range, typical for PBD dimers, to the nanomolar range of PBD monomers. To obtain the first generation of click-cleavable PBD dimers, the C2-symmetrical trans-cyclooctene (C2TCO) was incorporated as a bioothogonal linker. Quantitative release of monomers from the C2TCO-linked PBD dimer derivative was confirmed upon reaction with tetrazine. Cell experiments however revealed identical cytotoxicity of the C2TCO-linked dimer and the monomeric cleavage products in the nanomolar range indicating DNA mono-alkylation and no formation of cross-links. In contrast, previously described alkyl-linked PBD dimers were prepared as control compounds and shown to exhibit cytotoxicities in the picomolar range. The decreased toxicity of the C2TCO-linked dimers is hypothesized to result from steric clashes or the misalignment of the monomers due to linear implementation of C2TCO in the linker scaffold. While these findings show that the current strategy is not feasible to achieve bioorthogonal control of cytotoxicity, it paves the way to refined molecular designs to reduce the conformational influence of the click-cleavable moiety.

In den vergangenen Jahrzehnten wurden mehrere DNA-alkylierende Wirkstoffe, die auf der Grundstruktur der Pyrrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepine (PBDs) basieren, als potenzielle Krebstherapeutika, vor allem als DNA-vernetzende PBD-Dimere in Antikörper-Wirkstoff-Konjugaten (ADCs), klinisch geprüft. Bisher ist Zynlonta® das einzige von der FDA zugelassene PBD-ADC für die Behandlung von diffusem großzelligen B-Zell-Lymphoms, da die Arzneimittelzulassung der anderen Kandidaten aufgrund von undifferenziert hoher Toxizität oder schwerwiegender Off-Target-Effekte frühzeitig abgebrochen wurde.Diese Studie ebnet den Weg für das Konzept der bioorthogonalen Abschaltung von PBD-Dimerderivaten durch den click-to-release-Ansatz unter Verwendung von Tetrazin-Antidots, um die Toxizität zu kontrollieren. Diese Methode soll die Fähigkeit des PBD-Dimers zur Vernetzung von DNA durch schnelle (Sekunden bis Minuten) und vollständige (>99%) Spaltung der Dimerbindung deaktivieren, wodurch die Toxizität vom picomolaren IC50-Bereich, der für PBD-Dimere typisch ist, auf den nanomolaren Bereich von PBD-Monomeren sinkt. Um die erste Generation von klick-spaltbaren PBD-Dimeren zu erhalten, wurde das C2-symmetrische trans-cycloocten (C2TCO) als bioothogonaler Linker eingebaut. Die quantitative Freisetzung von Monomeren aus dem C2TCO-verknüpften PBD-Dimerderivat wurde bei der Reaktion mit Tetrazin bestätigt. Zellexperimente zeigten jedoch eine identische Zytotoxizität des C2TCO-verknüpften Dimers und der monomeren Spaltprodukte im nanomolaren Bereich, was auf eine Monoalkylierung von DNA und keine Bildung von Quervernetzungen hindeutet. Im Gegensatz dazu wurden zuvor beschriebene alkylverknüpfte PBD-Dimere als Kontrollverbindungen hergestellt und wiesen Zytotoxizitäten im picomolaren Bereich auf. Die geringere Toxizität der C2TCO-verknüpften Dimere ist vermutlich auf sterische Kollisionen oder die falsche Ausrichtung der Monomere aufgrund der linearen Implementierung von C2TCO in das Linkergerüst zurückzuführen.Diese Ergebnisse zeigen zwar, dass die derzeitige Strategie für eine bioorthogonale Kontrolle der Zytotoxizität nicht geeignet ist, ebnen aber den Weg für raffinierte Moleküldesigns zur Verringerung des konformationellen Einflusses der durch Klicken spaltbaren Komponente.