Unraveling the intrinsically disordered region of the oncoprotein cyclin D : a semi-synthetic and structural biology approach

Abstract

Anhand ihrer Involvierung in die Gentranskription, DNA-Synthese und Zellteilung zählen Cycline zu den Hauptregulatoren des Zellwachstums. Hierbei verleihen post-translationale Modifikationen diesen Proteinen die Möglichkeit zur Kommunikation und Interaktion mit zahlreich, weiteren Bindungspartnern. Diese chemischen Modifikationen ermöglichen eine völlige Umgestaltung der dreidimensionalen Proteinstruktur, wodurch sie deren Funktion, Stabilität und Lokalisierung innerhalb der Zelle beeinflussen. Bereits feine Abweichungen in der Kausalität zwischen Proteinstruktur und -funktion können zur Überregulierung von Genen, fehlerbehafteter DNA Verdopplung und unkontrollierter Zellteilung führen. Die Erforschung dieses sensiblen Wechselspiels zwischen Struktur und Funktion, ausgehend von post-translationalen Modifikationen, ermöglicht neue Einblicke in den zugrunde liegenden Mechanismus der Krankheitsentstehung auf molekularer und strukturbiologischer Basis. Die Präsenz von Cyclin D in zahlreichen Zellkompartimenten führt zur Interaktion mit zahlreichen Proteinen, oft ausgehend vom C-Terminus dieses Proteins. Dieser Proteinabschnitt gilt als höchst dynamisch und intrinsisch ungeordnet, was eine verlässliche Untersuchung oder gar Vorhersage der tatsächlichen Proteinstruktur erschwert. Es wird angenommen, dass Modifikationen in diesem Abschnitt die Funktion, Translokation und Abbau des Proteins diktieren. In diesem Zusammenhang wird die Phosphorylierung als Hauptmodifikation für Cyclin D wahrgenommen, jedoch ist unklar, welche Auswirkung diese Modifikation auf Struktur und Funktion hat.Diese Arbeit berichtet von der erfolgreichen Festphasen-Peptidsynthese und Aufreinigung des unmodifizierten und phosphorylierten C-Terminus von Cyclin D, in Kombination mit deren struktureller Charakterisierung durch kernmagnetische Resonanzspektroskopie. Hierbei gewannen wir Einblicke in die dynamische Struktur dieser intrinsisch ungeordneten Peptidstrukturen, anhand dieser wir potenzielle strukturelle Auswirkungen der Phosphorylierung zuordnen konnten. Umfassende Optimierungsversuche in der Synthese erlaubten uns die Erweiterung der erfolgreiche Synthese auf die gesamt intrinsisch ungeordneten Region von Cyclin D. Die entwickelte Synthese wird es uns ermöglichen, die bisherige Peptidsequenz in ihrer Länge zu erweitern und die Sammlung aller phosphorylierten Varianten zu komplettieren, um diese anschließend mittels kernmagnetischer Resonanzspektroskopie und Zirkulardichroismus auf Strukturmotive zu untersuchen. Großer Bestandteil dieser Arbeit war ebenfalls der Entwicklung und Durchführbarkeit der Semi-Synthese von Cyclin D basierend auf dem Prinzip der nativ-chemischen Ligation. Hierbei, wurde das Protein ohne des bereits synthetisierten Degron rekombinant in E.coli exprimiert und durch Anwendung mehrerer Reinigungsschritte isoliert. Die anschließende Abspaltung des Proteins von den zuvor angebrachten Affinität-Tags und der Intein-Einheit ermöglichte die Überführung in die aktivierte Thioester-Spezies, welche für die nativ chemische Ligation erforderlich war. Das Highlight dieser Arbeit stellt die erfolgreiche Ligation des rekombinant-exprimierten Proteins mit dessen synthetisierten Degrons dar. Folglich behandelt diese Arbeit die erfolgreiche Semi-Synthese von Cyclin D, eines der am häufigst vorkommenden Onkoproteine. Die folgende Aufreinigung wird uns den Zugang dieses Proteins und neue Einblicke in die globale dreidimensionale Struktur ermöglichen und dient als Proof-of-Concept für die anstehende Semi-Synthesen der phosphorylierten Spezien. Wir erhoffen uns, dass dies Licht in die ungeklärte Wechselwirkung zwischen Proteinstruktur und -funktion des Cyclin D bringt und uns folglich neue Einblicke in dessen Interaktion mit weiteren Bindungspartnern gewährt. Die vollständige Aufklärung der Struktur und der daraus resultierenden Funktion erachten wir als wesentlich für die Entwicklung neuer therapeutischer Konzepte.

Cyclins are the master regulators of cell cycle proliferation promoting gene transcription, genome duplication, and final cell division. The interplay with their downstream interaction partners is driven by post-translational modifications (PTMs), often located at the protein periphery in highly dynamic and less structured regions, the intrinsically disordered regions (IDR). These PTMs can reshape the three-dimensional protein structure and consequently, display a profound impact on the protein function, location, and stability. An aberrant (un)structure-function correlation causes gene overregulation, corrupted DNA synthesis, and uncontrolled cell division resulting in malignant transformation. To investigate the bias PTMs have on the structure and function of abundant oncoproteins would provide new insights into the mechanism of disease development from a molecular and structural biology perspective. Cyclin D is abundant in different cellular compartments and therefore, has many binding interaction partners, many of which bind at its C-terminus. This region is as highly dynamic and intrinsically disordered making proper structural prediction or characterization challenging. PTMs introduced in the C-degron region are believed to dictate its binding activity, intracellular trafficking, and proteasomal degradation. Here, the (de)phosphorylation potential of cyclin D is identified as a major contributor to tumorigenesis. The main goal of this project was the development and feasibility of a semi-synthesis strategy for cyclin D based on the native chemical ligation (NCL) principle. In this work, we demonstrate the successful solid-phase peptide synthesis of the native and phosphorylated degron of cyclin D, combined with its structural characterization by nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy. With this method, we gained local insight into the dynamic structure-function paradigm of cyclin D, which has strengthened our hypothesis of ongoing conformational changes upon phosphorylation. Extensive optimization in the protocol allowed the synthesis of the entire intrinsically disordered region of cyclin D. The established synthesis protocol enables us to expand our collection to all possible phosphorylated variants and elucidate their structural characteristics by NMR spectroscopy and circular dichroism (CD) spectroscopy. The main body of cyclin D protein without the degron peptide sequence was recombinantly expressed in E.coli, followed by its isolation by multiple purification techniques. Subsequent cleavage from the affinity tags allowed the simultaneous transformation into the activated thioester required for NCL. Finally, we could demonstrate a successful ligation between the recombinantly expressed protein to the synthesized unmodified phospho-degron of cyclin D.This work demonstrates the semi-synthesis of one of the most abundant oncogenes in solid tumors and will potentially enable us to synthesize, report, and investigate the protein full structure of the unmodified and phosphorylated variants of cyclin D. We hope that this brings light to the (un)structure-function paradigm of cyclin D in context of its most important PTMs and provides novel insights in binding mechanism to its downstream interaction partners. This might open the door for potential therapeutic concepts to target this pivotal oncoprotein involved in uncontrolled cell proliferation.