Towards new molecular glues for E3 ligase DCAF16

Abstract

Der gezielte Abbau von Proteinen unter Verwendung zelleigener Abbaumechanismen hat sich in den letzten zwei Jahrzehnten als neue therapeutische Strategie etabliert. Dass diese Strategie erfolgreich ist, kann an den vielen entsprechenden Medikamenten abgelesen werden, die sich derzeit in klinischen Studien befinden. Bislang nutzen diese Wirstoffmoleküle fast ausschließlich die E3 Ligase Cereblon, um den Proteinabbau zu initiieren. Das menschliche Genom beinhaltet jedoch mehr als 600 E3 Ligasen, welche für den gezielten Abbau potentiell verwendet werden könnten. Da jede E3 Ligase höchst spezifisch in Bezug auf ihre Substrate ist, könnte durch die Verwendung neuer E3 Ligasen die Bandbreite möglicher Targets enorm erweitert werden. Weiters könnte die Spezifität von zukünftigen Medikamenten drastisch erhöht werden, da viele E3 Ligasen zell-, gewebe- und tumorspezifisch gehäuft auftreten. DCAF16 ist eine E3 Ligase, welche derzeit noch unzureichend charakterisiert ist. Einige abbauinitiierende Moleküle, die auf DCAF16 basieren, wurden in den letzten Jahren bereits erforscht, unter ihnen beispielsweise das kovalent bindende Molekül MMH1 von Li et al. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war, einen Assay basierend auf MMH1 zu entwickeln, um neue Moleküle zu finden, die kovalent an DCAF16 binden. Dafür wurden zunächst Sondenmoleküle synthetisiert, die im Assay später mit neuen, potentiell an DCAF16 bindenden, Molekülen konkurrieren sollten. B1 war das erste erfolgreich hergestellte Sondenmolekül, es ist ein Derivat von MMH1, jedoch mit zusätzlicher Biotin-Funktionalität. Diese Funktionalität kann beispielsweise zur Visualisierung verwendet werden, um zu sehen, ob das Molekül an DCAF16 bindet. Da in einem anschließenden Zellexperiment jedoch nicht validiert werden konnte, dass B1 mit DCAF16 interagiert, wurde ein neues Sondenmolekül, genannt A1, synthetisiert. Anstelle der raumeinnehmenden Biotin-Funktionalität besitzt A1 ein Alkin. Diese Gruppe ist nicht nur kleiner, sondern ermöglicht mithilfe einer kupferkatalysierten Azid-Alkin-Cycloaddition das spätere Hinzufügen von Biotin oder einem Fluorophor. Im Anschluss an die erfolgreiche Synthese konnte bestätigt werden, dass A1 mit DCAF16 interagiert. Nach der Optimierung der Bedingungen für die Click-Reaktion gelang es, DCAF16 mit Cyanin5.5-Azid zu markieren. Dies gelang sowohl nach der Inkubation von Zelllysat mit A1 als auch nach der Inkubation von lebenden HeLa-Zellen mit A1. Da in den entsprechenden Western Blots auch unspezifisches Binden von A1 beobachtet wurde, wird ein wichtiger nächster Schritt die Validierung von DCAF16 als Target von A1 sein. Obwohl noch einige Feinheiten untersucht werden müssen, legt diese Arbeit den Grundstein für einen neuen kompetitiven Assay, um neue Wirkstoffmoleküle zu finden, die an DCAF16 binden.

In the last two decades, targeted protein degradation has emerged as a new therapeutic strategy whose success is attested by the large number of degraders that are currently in clinical studies. However, the successful degraders described so far, are almost exclusively based on E3 ligase Cereblon, while all of the other 600+ human E3 ligases are neglected. In general, E3 ligases exhibit a defined substrate specificity, thus, using new E3 ligases would enable to extend the scope of possible targets tremendously. Not only expanding the TPD toolbox, exploiting new E3 ligases will open the door for tissue or cell specific degradation too. DCAF16 is an E3 ligase that still remains insufficiently characterized, even though some degraders targeting DCAF16 are already described in the literature. One of those degraders is MMH1 from Li et al. that degrades the protein BRD4 by covalently binding DCAF16. Based on MMH1, the aim of this work was to develop a competition assay to find new covalent binders for DCAF16. First, probes were synthesized, which are meant to compete later on with potential new binders in the envisioned assay. The first probe B1, a derivative of MMH1 with an additional biotin moiety, was synthesized successfully. However, in cell studies it was not possible to confirm its interaction with DCAF16. Thus, a new probe, termed A1, was synthesized. Instead of the larger biotin moiety, A1 features an alkyne that allows copper-catalyzed azide–alkyne cycloadditions to install biotin or fluorophores later on for visualization of the binding event. Subsequently, A1 was confirmed to interact with DCAF16. After optimization of the click conditions, fluorescent labeling of DCAF16 with cyanine5.5-azide was achieved. The labeling was succeeded in both cases, in case of A1 treatment of cell lysates as well as A1 treatment of living HeLa cells. Especially as additional unspecific binding was observed, an important next step would be the validation of DCAF16 as target of A1. Although some fine-tuning remains to be done, this work lays the foundation for a new competition assay to find novel binders for the E3 ligase DCAF16.