Tool Compounds for peptide labeling in fluorescence microscopy and proteomics

Abstract

Chemical tool compounds are widely used in chemical biology to help decipher complex biological processes. In medicinal chemistry, functionalized pharmacophores have been utilized to probe specific interactions between a ligand and its target, leveraging techniques from the extensive chemical biology toolkit, including photoaffinity labeling and bioorthogonal chemistries. Furthermore, specific applications at the intersection of biology and analytics, such as biological fluorescence microscopy and proteomics, heavily depend on multifunctional chemical entities to bridge biological functionality with analytical readout. The work presented herein concerns the synthesis, characterization, and biological evaluation of such synthetic tool compounds for a diverse set of biological applications. The thesis is divided into three parts. The first part deals with the synthesis of functionalized phosphatidylinositols equipped with “clickable groups” and photoaffinity tags, intended for the study of the serotonin transporter ́s aggregation behavior by fluorescence microscopy. In this context, particular emphasis is placed on inositol desymmetrization and protection, the stereo- and regiospecific assembly of diacylglycerols, and phosphate couplings employing phosphoramidite chemistries.The second part shows the synthesis and partial biological characterization of multifunctional probes for applications in expansion microscopy, specifically intended to aid in deciphering the morphological architecture of the brain.Finally, the third part concerns caged Michael acceptors for the temporally resolved cysteine-selective labeling of proteins. These multifunctional labeling agents can be employed in the context of proteomics and bioconjugation, while simultaneously aiming at the mitigation of common drawbacks of conventional alkylating agents, such as low specificity and high toxicity. The synthesis and tetrazine-mediated uncaging of these isocyanide-based caged electrophiles are examined, alongside the biological characterization of two novel acrylic reagents for cysteine-selective labeling of polypeptides.

Synthetisch-chemische Verbindungen werden in der chemischen Biologie häufig verwendet, um komplexe biologische Prozesse zu entschlüsseln. In der medizinischen Chemie beispielsweise, werden funktionalisierte Pharmakophore eingesetzt, um spezifische Wechselwirkungen zwischen einem Liganden und seinem Zielprotein zu untersuchen, wobei Techniken aus dem umfangreichen Instrumentarium der chemischen Biologie genutzt werden, darunter Photoaffinitätsmarkierung und bioorthogonale Chemie. Darüber hinaus sind spezifische Anwendungen an der Schnittstelle zwischen Biologie und Analytik, wie biologische Fluoreszenzmikroskopie und Proteomik, in hohem Maße von multifunktionalen synthetischen Molekülen abhängig, um zelluläre Prozesse mit der jeweiligen analytischen Messmethode zu verknüpfen. Die hier vorgestellte Arbeit befasst sich mit der Synthese, sowie der strukturellen und biologischen Charakterisierung solcher synthetischen Verbindungen für eine Reihe biologischer Anwendungen. Die Arbeit ist in drei Teile gegliedert. Der erste Teil befasst sich mit der Synthese von funktionalisierten Phosphatidylinositolen, die mit aus dem Bereich der „Click“-chemie bekannten Funktionalitäten und Photoaffinitäts-Tags ausgestattet sind. Diese Verbindungen dienen der Untersuchung des Aggregationsverhaltens des Serotonin-Transporters mittels Fluoreszenzmikroskopie. In diesem Zusammenhang wird besonderer Wert auf die Desymmetrisierung von Inositolen und deren selektive Schützung, den stereo- und regiospezifischen Aufbau von Diacylglycerinen und Phosphatkopplungen unter Verwendung von Phosphoramidit-basierten Methoden gelegt.Der zweite Teil zeigt die Synthese und teilweise biologische Charakterisierung von multifunktionalen Molekülen für Anwendungen in der Expansionsmikroskopie, die speziell zur Entschlüsselung der morphologischen Architektur des Gehirns beitragen sollen.Im dritten Teil schließlich geht es um Caged-Michael-Akzeptoren für die zeitlich aufgelöste cysteinselektive Markierung von Proteinen. Diese multifunktionalen, markierenden Substanzen können im Rahmen der Proteomik und Biokonjugation eingesetzt werden, wobei gleichzeitig die Nachteile herkömmlicher Alkylierungsmittel, wie geringe Spezifität und hohe Toxizität, gemildert werden sollen. Die Synthese und die Tetrazin-vermittelte Freisetzung dieser auf Isocyaniden basierenden inaktivierten Elektrophile werden ebenso untersucht wie die biologische Charakterisierung von zwei neuartigen Acrylreagenzien für die cysteinselektive Markierung von Polypeptiden.