Towards bioorthogonal interlocking systems for RNA-targeting using peptide nucleic acids

Abstract

Antisense oligonucleotides (ASOs) are a class of gene therapeutic drugs which have gained increasing interest in various research fields due to their excellent selectivity and binding affinity towards biological targets such as ribonucleic acids (RNA). Peptide nucleic acids (PNAs) are RNA analogues with a peptidic structure and are heavily investigated as ASOs. The nucleobases attached to their backbone enable superior and selective hybridisation to complementary RNA strands. Nevertheless, the hybridisation to RNA is a weak interaction and dissociation of the PNA occurs fast. Within this work, the development of antisense probes that allow stabilisation of the formed duplex via bioorthogonal stapling was pursued: Upon hybridisation of a modified PNA with a target RNA strand, the formed PNA/RNA duplex can be mechanically interlocked using a bioorthogonal reaction with a staple molecule, covalently stabilising the PNA/RNA duplex and preventing dissociation. The tetrazine/trans-cyclooctene (Tz/TCO) ligation was chosen as conjugation method owing to its superior reaction kinetics and biocompatibility. This thesis focused on the development of a synthetic strategy towards a trans-cyclooctene staple molecule as well as tetrazine-tagged stapling antisense probes (SAPs). Within this work, several PNAs of different lengths and C-terminal functionalities were successfully synthesised, which can be used for preparation of SAPs. Future investigation of PNA/RNA duplex kinetics by Surface Plasmon Resonance (SPR) Spectroscopy will help identify the optimum length of SAPs and find the balance between cell uptake and dissociation from the target RNA.

Antisense-Oligonukleotide (ASO) sind eine Klasse von Gentherapeutika, die aufgrund ihrer hervorragenden Selektivität und Bindungsaffinität gegenüber biologischen Zielmolekülen wie Ribonukleinsäuren (RNS) auf zunehmendes Interesse in verschiedenen Forschungsbereichen stoßen. Peptidnukleinsäuren (PNS) sind RNS- Analoga mit einer peptidischen Struktur und werden als ASOs intensiv untersucht. Die an ihr Rückgrat gebundenen Nukleinbasen ermöglichen eine hervorragende und selektive Hybridisierung an komplementäre RNS-Stränge. Allerdings ist die Hybridisierung an RNS eine schwache Wechselwirkung und die Dissoziation der PNS erfolgt schnell und häufig. In dieser Arbeit wird die Entwicklung von Antisense-Proben angestrebt, die eine Stabilisierung des geformten Duplex durch bioorthogonale Verbindung ermöglichen: Nach Hybridisierung einer modifizierten PNS mit einem Ziel-RNS-Strang kann der gebildete PNS/RNS-Duplex durch eine bioorthogonale Reaktion mit einem Bindemolekül mechanisch eingeschlossen werden, was den PNS/RNS-Duplex kovalent stabilisiert und somit eine Dissoziation verhindert. Die entwickelte Strategie beinhaltet die Synthese von PNS mit kürzeren komplementären Sequenzen, um die Zellaufnahme zu erleichtern und die Wasserlöslichkeit der Oligomere zu verbessern. Die Tetrazin/trans-Cycloocten (Tz/TCO)-Ligation wurde aufgrund ihrer überlegenen Reaktionskinetik und Biokompatibilität als Konjugationsmethode gewählt.Im Rahmen dieser Arbeit wurden mehrere PNS mit unterschiedlichen Längen und C-terminalen Funktionalitäten erfolgreich synthetisiert, die für die Herstellung von AEP verwendet werden können. Weitere Untersuchungen der Kinetik von PNS/RNS- Duplexen mittels Oberflächenplasmonenresonanz (SPR)-Spektroskopie werden dazu beitragen, die optimale Länge von AEP und einen Kompromiss zwischen Zellaufnahme und Dissoziation von der Ziel-RNS zu ermitteln.