Towards light-induced capture of RNA by clickable peptide nucleic acids

Abstract

Nucleic acid sensors are powerful tools for detecting clinically relevant specific nucleic acid sequences for biomedical research and diagnosis. In this context, assays based on nucleic acid hybridization between a target and a capture probe sequence offer a simple and effective technique for highly selective nucleic acid detection. However, the sensitivity of these sensors is limited, as hybridized strands are stabilized only by weak interactions. Harsh conditions used to remove physically adsorbed biomolecules that interfere with nucleic acid detection may enhance target strand dissociation and reduce the sensor's sensitivity. Therefore, improving the stability of the formed duplex between the capture probe and the target strand is crucial to enhance the sensitivity of the sensor.To achieve this goal, the proposed thesis aims to establish the synthesis of modified peptide nucleic acids (PNAs), which are capable of quasi-covalently locking target ribonucleic acids (RNAs) upon hybridization. This modification is hypothesized to increase the stability of the duplex. UV light-induced 1,3-dipolar cycloaddition between photoactive tags, a tetrazole and an alkene allows “locking” of PNA-RNA duplex. Clickable monomers were integrated in the PNA using solid phase peptide synthesis (SPPS). The binding kinetics of a synthesized reference PNA capture probe and its complementary RNA were studied via surface plasmon resonance spectroscopy (SPR). In summary, this thesis describes the successful establishment of a synthesis for photoclickable monomers bearing tetrazole or alkene moieties, as well as their efficient integration in PNA strands. These results paves the way for the development of nucleic acid sensors with enhanced sensitivity.

Nukleinsäure Sensoren sind ein wichtiges Werkzeug für die Detektion von klinisch relevanten spezifischen Nucleinsäure- Sequenzen für biomedizinische Forschung und Diagnose. In diesem Kontext, wurden Assays basierend auf der Hybridisierung von Nucleinsäuren entwickelt. Die Hybridisierung erfolgt dabei zwischen einem Target und einer Fangsonde. Diese Methode bietet eine einfache und effektive Technik für eine hochselektive Detektion von Nukleinsäuren. Nichtsdestotrotz ist die Sensibilität dieser Sensoren limitiert, da hybridisierte Stränge nur durch schwache Wechselwirkungen stabilisiert werden. Stringente Bedingungen zur Entfernung von physikalisch adsorbierten Biomolekülen, begünstigen die Dissoziation des Targets und reduzieren dabei die Sensibilität des Sensors. Deshalb muss die Stabilität der geformten Duplex zwischen der Fangsonde und dem Target-Strang erhöht werden um die Sensibilität des Sensors zu verbessern. Um dieses Ziel zu erreichen, etabliert die hier vorgestellte Arbeit die Synthese von modifizierten Peptid-Nukleinsäuren (PNAs), welche nach Hybridisierung von Ribo- nukleinsäuren (RNAs) in der Lage sind, diese quasi-kovalent zu fixieren. Es wird daher angenommen, dass diese Modifizierung die Stabilität der Duplex erhöht. Die dafür angewendeten Reaktionen beinhalten UV-Licht induzierte 1,3-dipolare Cyclo- additionen zwischen eingeführten photoaktiven Tags , welche das Fixieren der PNA- RNA Duplex ermöglichen. Die clickbaren Monomere und Tags wurden in den PNA-Strang durch Festphasenpeptidsynthese (SPPS) eingebaut. Weiters, wurde die Hybridisierung der Referenz RNA mit einem komplementären RNA-Strang mittels Oberfächenplasmonenresonanzspektroskopie (SPR) untersucht. Zusammenfassend beschreibt diese Arbeit die erfolgreiche Etablierung eines Protokolls für die Synthese von photoclickbaren Monomeren, sowie deren effizienten Einbau in PNA-Stränge. Zusammen mit ersten kinetischen Messungen ebnet diese Arbeit den Weg für die Entwicklung von Nukleinsäure-Sensoren mit erhöhter Sensibilität.