Establishing fast-growing cyanobacteria as platform for whole-cell catalysis

Abstract

Klimawandel stellt die bedeutendste Herausforderung dar, der die Menschheit je gegenüberstand, und wird hauptsächlich durch anthropogene Treibhausgasemissionen und Umweltzerstörung vorangetrieben. Eine rasche Dekarbonisierung und die Minimierung industrieller Abfallströme sind entscheidend, um die Auswirkungen abzumildern. Cyanobakterien bieten einen vielversprechenden Weg, um die Biotechnologie in eine kohlenstoffneutrale oder sogar kohlenstoffnegative Industrie zu verwandeln.Cyanobakterien sind urzeitliche Prokaryoten, die zur oxygenenen Photosynthese fähig sind. Ihr photoautotropher Stoffwechsel ermöglicht es ihnen, Licht als Energiequelle und atmosphärisches CO2 als Kohlenstoffquelle zu nutzen, wobei sie lediglich Wasser und Salze benötigen. Diese Eigenschaften machen sie besonders geeignet für biotechnologische Anwendungen, da sie CO2 in wertvolle Produkte umwandeln können, wie durch mehrere Machbarkeitsstudien und begrenzte industrielle Anwendungen, etwa in der Produktion von Nahrungsergänzungsmitteln und Pigmenten, gezeigt werden konnte. Darüber hinaus verfügen Cyanobakterien über vorteilhafte Eigenschaften für die Ganzzellkatalyse.Die Ganzzellkatalyse ist ein Teilbereich der Biokatalyse, bei dem statt eines isolierten Enzyms die gesamte Zelle als Reaktionsgefäß genutzt wird, um die Reaktion durchzuführen. Dadurch wird das Enzym stabilisiert, der pH-Wert und der osmotische Druck reguliert und es können sogar Co-Faktoren wie ATP oder NADPH recycelt werden. Traditionelle Ganzzellsysteme erfordern jedoch oft zusätzliche Verbindungen wie Glukose für das Cofaktor-Recycling, was zusätzliche Kosten und Umweltbelastungen mit sich bringt. Cyanobakterien können diese Einschränkung überwinden, indem sie Lichtenergie durch Photosynthese in biologisch verfügbare Energie umwandeln. Zudem kann die In-situ-Produktion von Sauerstoff die bei der Ganzzellkatalyse auftretenden Probleme der Sauerstoffübertragung verhindern.Trotz dieser Vorteile wird die Anwendung von Cyanobakterien in industriellen Prozessen durch ihr langsames Wachstum und die geringe Biomasseproduktion im Vergleich zu herkömmlichen Bakterien wie E. coli behindert, was sie wirtschaftlich unrentabel macht. Allerdings bieten jüngste Entdeckungen schnell wachsender Cyanobakterienstämme, wie Synechococcus sp. UTEX2973 und Synechococcus sp. PCC11901, mit Verdopplungszeiten, die mit Hefearten wie Saccharomyces cerevisiae und Pichia pastoris vergleichbar sind, neue Möglichkeiten in der Cyanobakterien-Biotechnologie.Diese Studie zielte darauf ab, schnell wachsende Cyanobakterien als Plattform für die Ganzzellkatalyse zu entwickeln. Zwei biokatalytische Ansätze wurden mit den schnell wachsenden Stämmen Synechococcus sp. UTEX2973 und Synechococcus sp. PCC11901 untersucht.XVIIIDer erste Ansatz konzentrierte sich auf die Expression einer Carbonsäurereduktase (CAR) in Synechococcus sp. UTEX2973. CARs wandeln Carbonsäuregruppen in ihre entsprechenden Aldehyde um, eine chemisch anspruchsvolle Reaktion. Das Enzym benötigt jeweils ein Molekül ATP und NADPH pro Reaktion, was eine Belastung für den Stoffwechsel des Wirts darstellt. Der effiziente photosynthetische Mechanismus von S. sp. UTEX2973 eignet sich gut zur Bereitstellung dieser Cofaktoren. Darüber hinaus wurde die Flux Balance Analyse (FBA) als Werkzeug zur Identifizierung von Gen-Knockouts untersucht, die den Fluss reduzierender Äquivalente in Richtung der gewünschten Reaktion steigern könnten. Das Projekt stieß jedoch auf technische Schwierigkeiten beim Klonieren von CAR in einen geeigneten Vektor für S. sp. UTEX2973.Der zweite Ansatz konzentrierte sich auf Synechococcus sp. PCC11901 und eine zweistufige enzymatische Kaskade. S. sp. PCC11901 hat sich als fähig erwiesen, höhere Zelldichten als andere Cyanobakterienstämme zu erreichen, was ihn zu einem vielversprechenden Kandidaten für industrielle Anwendungen macht. Die in diesem System verwendeten Enzyme waren ein Phenolsäuredecarboxylase (PAD) und ein aromatische Dioxygenase (ADO), die zusammen Ferulasäure, eine aus Lignin gewonnene aromatische Verbindung, in die wertvolle Verbindung Vanillin umwandeln. Der erste Schritt, katalysiert durch PAD, produziert 4-Vinylguaiacol und setzt CO2 frei, während der zweite Schritt, katalysiert durch ADO, Sauerstoff benötigt. Durch die Nutzung der Photosynthese wird die Reaktion selbsttragend, was das Problem der CO2-Erschöpfung in geschlossenen Systemen löst.Nach der Integration von PAD in das Genom von Synechococcus sp. PCC11901 wurde die Toxizität von 4-Vinylguaiacol als Hauptinhibitor ermittelt. Die Hydrophobizität von 4-Vinylguaiacol im Vergleich zu Ferulasäure ermöglichte eine In-situ-Produktentfernung mit einem organischen Lösungsmittel. Der Einsatz von hydrophoben Lösungsmitteln wie Diisononylphthalat (DINP) verbesserte die Ausbeuten. Aufgrund von Umweltbedenken wurden alternative Lösungsmittel evaluiert, und Isopropylmyristat zeigte ähnliche Ergebnisse wie DINP, während es als „grünes Lösungsmittel“ gilt. Der Prozess wurde auf ein Gram hochskaliert, wobei eine Ausbeute von 80 mM 4-Vinylguaiacol erzielt wurde, die höchste berichtete Ausbeute für Ganzzellkatalyse in Cyanobakterien.Versuche, ADO in S. sp. PCC11901 zu integrieren, waren erfolglos, und das ADO-Enzym selbst zeigte begrenzte Ausbeuten und Aktivität. Durch Genom-Mining wurde eine vielversprechendere ADO-Variante aus Moesziomyces aphidis (genannt mapADO) identifiziert, deren Expression in Cyanobakterien jedoch ebenfalls erfolglos war. Anschließend wurde ein gemischter Artenansatz mit E. coli, welche mapADO exprimierte, neben S. sp. PCC11901 getestet, um die zweistufige Umwandlung von Ferulasäure zu Vanillin durchzuführen, was die Vanillinproduktion erfolgreich erhöhte.

Climate change represents the most significant challenge humanity has ever faced, driven largely by anthropogenic greenhouse gas emissions and environmental degradation. Rapid decarbonization and minimizing industrial waste streams are critical for mitigating its impact. Cyanobacteria offer a promising avenue to transform biotechnology into a carbon-neutral or even carbon-negative industry.Cyanobacteria are ancient prokaryotes capable of oxygenic photosynthesis. Their photoautotrophic metabolism enables them to harness light as an energy source and atmospheric CO2 as a carbon source, requiring only water and salts. These characteristics make them highly suitable for biotechnological applications, allowing the conversion of CO2 into valuable products, as demonstrated by several proof-of-concept studies and limited industrial-scale applications, such as in the production of nutraceuticals and pigments. Furthermore, cyanobacteria possess advantageous traits for whole-cell catalysis.Whole-cell catalysis is a subset of biocatalysis and instead of isolating an enzyme to catalyze the reaction of interest, the cell is intact and thus provides a reaction vessel for the reaction and so stabilizes the enzyme(s), regulates pH and osmotic pressure, and can even provide a recycling system for required co-factors, such as ATP or NADPH. However, traditional whole-cell systems often require sacrificial compounds like glucose for cofactor recycling, which adds cost and environmental burden. Cyanobacteria can overcome this limitation by converting light energy into biologically available energy through photosynthesis. Moreover, the in situ production of oxygen can mitigate limitations associated with oxygen transfer in whole-cell catalysis.Despite these advantages, the application of cyanobacteria in industrial-scale processes is hindered by their slow growth and low biomass accumulation compared to conventional bacteria such as E. coli, making them less economically viable. However, recent discoveries of fast-growing cyanobacterial strains, such as Synechococcus sp. UTEX2973 and Synechococcus sp. PCC11901, with doubling times comparable to yeast species like Saccharomyces cerevisiae and Pichia pastoris, present new opportunities in cyanobacterial biotechnology.This study aimed to develop fast-growing cyanobacteria as a platform for whole-cell catalysis. Two biocatalytic approaches were explored using the fast-growing strains Synechococcus sp. UTEX2973 and Synechococcus sp. PCC11901.The first approach focused on expressing a carboxylic acid reductase (CAR) in Synechococcus sp. UTEX2973. CARs convert carboxylic acid moieties into their corresponding aldehyde, a chemically challenging reaction. The enzyme requires one molecule of ATP and NADPH each per reaction, posing a burden on the host's metabolism. The efficient photosynthetic machinery of S. sp. UTEX2973 is well suited to supply these cofactors. Additionally, Flux Balance Analysis (FBA) was investigated as a tool to identify gene knockouts that could enhance the flux of reducing equivalentsXVItoward the desired reaction. However, the project faced technical challenges related to cloning CAR into a suitable vector for S. sp. UTEX2973.The second approach focused on Synechococcus sp. PCC11901 and a two-step enzymatic cascade. S. sp. PCC11901 has shown the ability to accumulate higher cell densities than other cyanobacterial strains, making it a promising candidate for industrial applications. The enzymes used in this system were phenolic acid decarboxylase (PAD) and aromatic dioxygenase (ADO), which together convert ferulic acid, a lignin-derived aromatic compound, into the high-value compound vanillin. The first step, catalyzed by PAD, produces 4-vinyl guaiacol and releases CO2, while the second step, catalyzed by ADO, requires oxygen. By leveraging photosynthesis, the reaction becomes self-fueling, addressing the issue of CO2 depletion in closed systems.After the integration of PAD into the genome of Synechococcus sp. PCC11901, the toxicity of 4-vinyl guaiacol was determined as the main inhibitor. The hydrophobicity of 4-vinyl guaiacol compared to ferulic aid allowed an in situ product removal with an organic solvent. The use of in situ product removal with hydrophobic solvents such as diisononyl phthalate (DINP) improved yields. Due to environmental concerns, alternative solvents were evaluated and isopropyl myristate showed similar results to DINP while being considered a ‘green solvent’. The process was scaled up to gram-scale production, achieving a yield of 80 mM 4-vinyl guaiacol, the highest reported yield for whole-cell catalysis in cyanobacteria.Attempts to integrate ADO into S. sp. PCC11901 were unsuccessful, and the ADO enzyme itself displayed limited yields and activity. Genome mining identified a more promising ADO variant from Moesziomyces aphidis (termed mapADO), though its expression in cyanobacteria was also unsuccessful. Subsequently, a mixed-species approach using E. coli expressing mapADO alongside S. sp. PCC11901 was tested to perform the two-step conversion from ferulic acid to vanillin and successfully increased vanillin production.