Deep learning-based quantification of 5-HT2C receptor immunofluorescence-labelling in human spinal motoneurons

Abstract

Lumbar motoneurons are controlled by spinal central pattern generator networks to generate locomotion. Motoneuron excitability relies on brainstem-derived serotonergic (5-HT) activation of 5-HT receptors, including 5-HT2C receptors. In this project, an image processing pipeline is implemented for the segmentation and analysis of motoneurons and 5-HT2C receptor signal in multispectral fluorescence image scans. A dataset comprising whole human lumbar cross-sectional spinal cord tissue scans from neurologically intact control and spinal cord injury (SCI) cases is processed to validate the pipeline and to analyze the influence of SCI on the 5-HT2C receptor expression and distribution in lumbar motoneurons.A series of preprocessing steps, including spectral fluorescence unmixing, are comprised in the pipeline. In a deep learning-based approach for motoneuron segmentation, neuronal networks of the Cellpose project pretrained for cell detection are retrained on a NVIDIA A100-80GB-SXM-GPU using locally annotated image data. 5-HT2C receptor signal is segmented using entropy-based thresholding methods. The performance of the pipeline is validated by demonstrating its ability to segment both shape-based and grayscale intensity signals through comparisons with ground truth annotations and the application of established machine learning evaluation metrics.The pipeline is applied to describe the motoneuronal 5-HT2C receptor distribution in the human SCI spinal cord for the first time and reveals time-dependent changes throughout different SCI stages. The most striking finding made is a severely reduced 5-HT2C receptor expression in subacute SCI cases. An increased 5-HT2C receptor internalization in motoneurons, an indirect marker of constitutive receptor activity observed in a study in chronic spinal rats, could not be confirmed in human SCI cases.The findings of this project are of clinical relevance because 5-HT2C receptor activity has not only been associated with the recovery of motoneuron excitability, but also with the generation of maladaptive spasticity in chronic SCI animals. Thus, the 5-HT2C receptor could be a target for pharmacological approaches early after SCI to prevent the development of chronic maladaptive spasticity.

Lumbale Motoneurone werden von spinalen Central Pattern Generator Netzwerken gesteuert, um die Fortbewegung zu koordinieren. Die Erregbarkeit der Motoneurone hängt von bestimmten, durch Serotonin (5-HT) aus dem Hirnstamm aktivierten 5-HT-Rezeptoren ab, wie den 5-HT2C-Rezeptoren. In diesem Projekt wird eine Bildverarbeitungspipeline zur Segmentierung und Analyse von Motoneuronen und 5-HT2C-Rezeptorsignal in multispektralen Fluoreszenzmikroskopbildern implementiert. Ein Datensatz mit ganzen humanen Lendenrückenmarksgewebeschnitten von neurologisch intakten Kontrollfällen und Fällen mit Rückenmarksverletzungen wird verarbeitet, um die Pipeline zu validieren und den Einfluss von Rückenmarksverletzungen auf Expression und Verteilung der 5-HT2C-Rezeptoren in lumbalen Motoneuronen zu analysieren. Eine Serie von Bildvorverarbeitungschritten, einschließlich Entmischung spektraler Fluoreszenzsignale, ist in der Pipeline beinhaltet. In einem Deep-Learning-basierten Ansatz zur Motoneuronensegmentierung werden für die Zellerkennung vortrainierte neuronale Netzwerke des Cellpose-Projekts unter Verwendung lokal annotierter Bilddaten auf einer NVIDIA A100-80GB-SXM-GPU trainiert. Das 5-HT2C-Rezeptorsignal wird mithilfe entropiebasierter Schwellenwertverfahren segmentiert. Die Leistungsfähigkeit der Pipeline wird validiert, indem ihre Eignung zur Segmentierung formenbasierter und graustufenbasierter Intensitätssignale anhand von Vergleichen mit Ground-Truth-Annotationen sowie der Anwendung etablierter Bewertungsmetriken für maschinelles Lernen demonstriert wird. Die Pipeline wird verwendet, um erstmals die Verteilung motoneuronaler 5-HT2C-Rezeptoren im menschlichen Rückenmark mit Querschnittsverletzung zu beschreiben, und legt zeitabhängige Veränderungen während der verschiedenen Phasen einer Rückenmarksverletzung nahe. Die bemerkenswerteste mithilfe der Pipeline erlangte Erkenntnis ist, dass die Expression des 5-HT2C-Rezeptors in Fällen mit subakuter Rückenmarksverletzung stark reduziert ist. Der Trend verstärkter 5-HT2C-Rezeptorinternalisierung in Motoneuronen als indirekter Hinweis auf konstitutive Aktivität des Rezeptors, der in einer vorherigen Studie an Ratten mit chronischer Rückenmarksverletzung beobachtet wurde, konnte bei Menschen mit Rückenmarksverletzung nicht bestätigt werden. Die Ergebnisse dieses Projekt sind von klinischer Relevanz, da die Aktivität der 5-HT2C-Rezeptoren nicht nur mit der Wiederherstellung der Erregbarkeit der Motoneurone, sondern auch mit der Entstehung maladaptiver Spastizität bei Tieren mit chronischen Rückenmarksverletzungen in Zusammenhang gebracht wurde. Daher könnte der 5-HT2C-Rezeptor im Frühstadium einer Rückenmarksverletzung ein Ziel für pharmakologische Ansätze mit 5-HT-Wirkstoffen sein, um die Entwicklung chronischer maladaptiver Spastizität zu verhindern.