Genetic engineering of Aureobasidium pullulans based on the gene ura3 and the role of Dia3 in the biosynthetic pathway of diaporthinic acid in Trichoderma reesei

Abstract

Aureobasidium ist ein polymorpher und ubiquitärer Pilz, der sich durch seine morphologische Plastizität und die Fähigkeit auszeichnet, in oligotrophen Umgebungen zu wachsen und sich an atypische Lebensräume anzupassen. Industriell ist A. pullulans sehr signifikant, da die meisten Stämme das extrazelluläre Polysaccharid Pullulan produzieren können.Das Ziel dieser Arbeit war es, einen Deletionsstamm von A. pullulans EXF-150 zu generieren, mit der weiteren Perspektive, ein simples molekulares Werkzeug für die genetische Manipulation des Pilzes zu entwickeln. Für die Deletion wurde das Gen ura3 gewählt, das für Orotidin-5’-phosphat-Decarboxylase kodiert. Ein aktives Gen führt zur Expression von Orotidin-5’-phosphat-4-decarboxylase, welche die Decarboxylierung von Orotidine 5-Monophosphate (OMP) zu Uridine Monophosphate (UMP) katalysiert. Durch Zugabe von 5-Fluoroorotic Acid (5-FOA) zum Selektionsmedium, wandelt das Enzym 5-FOA in 5-Fluorouracil um, was zwangsläufig zum Zelltod führt. Im Gegensatz dazu kann bei einer erfolgreichen Deletion des Gens 5-FOA nicht in 5-Fluoruracil umgewandelt werden, was wiederum zu lebensfähigen Zellen führt.Die angestrebte Deletion des Gens ura3 durch Protoplasten vermittelte und chemische Transformation führte zu einer Missense-Mutation, bei der eine Nukleinsäurebasensubstitution (C zu A) zu einer Aminosäuresubstitution (Cystein zu Alanin) führt. Durch die induzierte Substitution konnten die Stämme in weiterer Folge auf das Selektionsmedium wachsen. Dieses Ergebnis ist möglicherweise auf einen Funktionsverlust des Proteins aufgrund der Aminosäuresubstitution zurückzuführen. Darüber hinaus kann angenommen werden, dass die Mutation durch die Cas9-Aktivität induziert wird, da sie in unmittelbarer Nähe der angestrebten Schnittstelle von Cas9 auftritt. Dies kann wiederum eine Konsequenz ungenauer DNA-Reparaturmechanismen sein.Diese Arbeit unterstreicht wiederkehrende Probleme verschiedener Transformationsmethoden und zeigt, wie diese einen Stressfaktor für die Organismen darstellen können, der sie wiederum dazu zwingt, sich an unvorteilhafte Lebensräume anzupassen.Der filamentöse, mesophile, saprophytische Pilz Trichoderma reesei ist einer der potenten-testen modernen Wirte für die industrielle Produktion von Enzymen und Proteinen. In den letzten Jahren fokusiert sich die Forschung deutlich mehr auf die Charakterisierung und auf das bessere Verständnis von Sekundärmetaboliten, aufgrund ihrer diversen biologischen Eigenschaften. Häufig werden diese von biosynthetischen Genclustern (BGCs) kodiert und hauptsächlich dann produziert, wenn der Mikroorganismus nur über begrenzte Ressourcen verfügt, um unter rauen Bedingungen überleben zu können.Der dia BGC hat das Interesse der Forscher geweckt, da die beteiligten Metaboliten potenziell antimykotische und antimikrobielle Wirkungen haben. In T. reesei wurde der dia BGC noch nicht umfassend untersucht, und um Einblicke in den dia BGC zu gewinnen, ist eine Aktivierung des Clusters erforderlich. Daher wurde diaR1, das für das Zinkclusterprotein kodiert, zuvor durch Positionierung der kodierenden Region unter der Regulation des TEF1-Promotors überexprim-iert, was zu dem als OEdiaR1 bezeichneten Überexpressionsstamm führte. Darüber hinaus wurden OEdiaR1-Deletionsmutanten konstruiert und ihre Transkriptionsniveaus analysiert. Ein Wildtyp-Deletionsmutant (QM6a ∆mus53) wurde konstruiert, wobei das Gen dia3 deletiert wurde. Zu diesem Zweck wurde eine Hygromycin-Split-Marker-Strategie angewendet. Der weit-ere Vergleich der Stämme umfasste eine Wachstumsanalyse aller Stämme mittels Mikroskopie. Darüber hinaus wurde das Trockenzellgewicht der Biomasseproduktion aller Deletionsstämme mit dem Wildtyp verglichen.Im Zuge dieser Arbeit wurde gezeigt, dass der dia3 Deletionsstamm die niedrigsten Transkript-Expresisonswerte aufweist. Dies wurde weiters durch eienn visuellen Vergleich aller Stämme bestätigt, da sich der Stamm ∆dia3 durch ein beeinträchtigtes Wachstum auszeichnet. Dies weist auf die Bedeutung von dia3 im dia BGC hin. Darüber hinaus ergab die visuelle und mikroskopische Analyse eine leichte Wachstumsbeeinträchtigung aufgrund der Überexpression des dia BGC (OEdiaR1), was auf eine leichte Wachstumsinhibierung aufgrund der Aktivierung des dia BGC hindeutet. Dies scheint wiederum durch die Deletion von dia1 revidiert zu werden.Diese Ergebnisse betonen die Bedeutung des Gens dia3 im dia BGC und zeigen die Komplexität des Stoffwechselwegs zur Produktion von Diaporthinsäure, was zu einem besseren Verständnis des dia BGC beiträgt.

The yeast-like genus Aureobasidium is a polymorphic, multi-budding, ubiquitous fungus often encountered in various locations. The organism is characterized by morphological plasticity and the ability to thrive in oligotrophic environments, adapting to unique and atypical habitats. Industrially, A. pullulans is highly significant, since most strains are able to produce the extracel-lular polysaccharide pullulan.The aim of this work was to obtain a deletion strain of A. pullulans EXF-150, with the further perspective of achieving a simple molecular tool for the genetic manipulation of the yeast-like fungus. Therefore the gene ura3 was targeted, encoding for orotidine 5’-phosphate decar-boxylase. An active gene results in the expression of orotidine 5’-phosphate 4-decarboxylase, catalyzing the decarboxylation of Orotidine 5-Monophosphate (OMP) to Uridine Monophos-phate (UMP). When 5-Fluoroorotic Acid (5-FOA) is added to the selection medium, the enzyme converts 5-FOA to 5-fluorouracil, inevitably leading to cell death. On the contrary, a successful deletion of the gene, 5-FOA cannot be converted to 5-fluorouracil, resulting in viable cells.Intended deletion of the gene ura3 via protoplast-mediated and chemical transformation resulted in an induced missense mutation, whereby a nucleic acid base substitution (C to A), leads to an amino acid substitution (cysteine to alanine). The generated deletion strains were capable of growing on selction medium containg 5-FOA. This outcome is suspected to be connected to protein loss of function, due to the amino acid substitution. Furthermore, it can be assumed that the mutation is induced by Cas9 activity, since it occurs in close proximity to the intented cut site of Cas9. This again can occur as a consequence of inaccurate DNA repair mechanisms.The study emphasizes reoccuring problems of different transformation methods and shows how these can pose as a stress factor for the organisms, forcing them to adapt to unfavourable habitats.The filamentous, mesophilic, saprophytic fungus Trichoderma reesei is one of the most potent modern hosts for the industrial production of a plethora of enzymes and proteis. Nevertehless, for the past decades research focused on the properties of secondary metabolites due to their importance. Secondary metabolites are often encoded by biosynthetic gene clusters (BGCs) and mainly produced when the microorganism has limited resources, enabling survival in harsh conditions. The dia BGC has aroused the interest of researchers, because of the potential antifungal and antimicrobial activities of the involved metabolites. In T. reesei the dia BGC has yet not been extensively studied and to gain some insight in the dia BGC, activation of the cluster is required. Therefore, diaR1, encoding the zinc cluster protein, was previously overexpressed by positioning the coding region under the regulation of the TEF1 promotor, resulting in the overexpression strain designated OEdiaR1. Furthermore, OEdiaR1 deletion mutants were constructed and their transcript levels were analysed.A wild type (QM6a ∆mus53) deletion mutant was constructed, whereby the gene dia3 was deleted. For this purpose a hygromycin split marker strategy was applied. Further comparison of the strains involved growth analysis by microscopy. In addition, the dry cell weight, and tehreby the biomass production, was compared for all deletion strains to the wild type.In the scope of this work it was revealed that, the lowest transcript abundance values were observed, when dia3 is deleted. This outcome was supported by visual comparison of all strains, whereby it was observed that the deletion strain ∆dia3 has an impaired growth. This indicates the significance of dia3 in the dia BGC. Furthermore, visual and microscopic analysis revealed a slight growth impairment due to the over expression of the dia BGC (OEdiaR1), indicating a mild growth inhibition due to the activation of the dia BGC. This again seems to be counteracted by the deletion of dia1.These findings empahsize the significance of the gene dia3 in the dia BGC and show the complexicity of the metabolic pathway for the production of diaporthinic acid, contributing to a better understanding of the dia BGC.