Determining the size and diffusion properties of the serotonin transporter using live-cell micropatterning in CAD cells

Abstract

Der Serotonintransporter (SERT) ist ein Monoamin-Natrium-Symporter, der für die Wiederaufnahme von Serotonin in präsynaptischen Neuronen verantwortlich ist und ein zentrales Ziel bei der Behandlung von Erkrankungen des Zentralnervensystems darstellt. SERT bildet Oligomere in der Plasmamembran, doch ist die funktionelle Rolle dieser Oligomerisierung bislang kaum verstanden. In dieser Arbeit wurde untersucht, ob SERT-Oligomerisierung die Fähigkeitdes Transporters beeinflusst, Diffusionsbarrieren in der Plasmamembran zu überwinden. Dies könnte einen Mechanismus zur Regulierung der Transportermobilität darstellen. Zu diesem Zweck kombinierten wir Protein-Mikrostrukturierung und Fluoreszenzmikroskopie, um definierte Bereiche mit hoher Hindernisdichte in lebenden Zellmembranen zu erzeugen. Mittels Einzelmolekülverfolgung fluoreszenzmarkierter SERT-Komplexe verglichen wir die Diffusion innerhalb und außerhalb dieser Bereiche und schätzten die effektive Größe der Oligomere, die in der Lage sind, Diffusionsbarrieren zu überwinden, ab. Zusätzlich wurden Experimente unter PIP2-Depletionsbedingungen durchgeführt, von denen bekannt ist, dass sie die Oligomerverteilung hin zu kleineren Spezies verschieben. Mittels FRAP-Mikroskopie wurde ein potenzielles Einfangen von Oligomeren beurteiltund mithilfe einer Kontrastanalyse von Bulk-Fluoreszenzbildern größenabhängige Ausschlusseffekte bewertet. Mobilitätsmessungen deuteten darauf hin, dass die effektive Größe von SERT Komplexen, die in der Lage sind, Diffusionsbarrieren zu durchdringen, zwischen der von Monomeren und Trimeren liegt und sich bei PIP2-Depletion um etwa 1 nm vergrößert. FRAP-Experimente lieferten keine Hinweise darauf, dass Oligomere in Bereichen mit erhöhtem Hindernisaufkommen eingeschlossen werden. Die aus der Fluoreszenzkontrastanalyse abgeleiteten Größenschätzungen waren quantitativ nicht zuverlässig, stützten jedoch qualitativ eine Verschiebung hin zu kleineren Oligomeren bei PIP2-Depletion. Insgesamt deuten die Ergebnisse darauf hin, dass größere SERT-Oligomere von Diffusionsbarrieren ausgeschlossen werden, während kleinere Spezies mobil bleiben. Die beobachtete Verschiebung hin zu größeren mobilen Oligomeren bei PIP2-Depletion deutet auf eine Umverteilung innerhalb der zugänglichen Oligomerpopulation hin und stützt die Annahme, dass die Oligomerisierung zur Regulation der SERT-Mobilität und der räumlichen Organisation in der Plasmamembran beitragen könnte.

The serotonin transporter (SERT) is a monoamine sodium symporter responsiblefor serotonin reuptake in presynaptic neurons and is a key target in the treatmentof central nervous system disorders. While SERT is known to form oligomers inthe plasma membrane, the functional role of this oligomerization remains poorlyunderstood. In this work, we investigated whether SERT oligomerization influences its abilityto navigate diffusional barriers in the plasma membrane, which may represent amechanism for regulating transporter mobility. To this end, protein micropatterningand fluorescence microscopy were combined to create defined regions of highobstacle density in living cell membranes. Single-molecule tracking of fluorescentlylabeled SERT complexes was used to compare diffusion inside and outside these regions and to estimate the effective size of oligomers capable of entering diffusional barriers. Experiments were additionally performed under PIP2 depletion conditions, which are known to shift the oligomer distribution toward smaller species. Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) was employed to assess potential trapping of oligomers, and contrast analysis of bulk fluorescence images was used to evaluate size-dependent exclusion effects. Mobility measurements indicated that the effective size of SERT complexes capable of entering diffusional barriers lies between those of monomers and trimers, and increases by approximately 1 nm upon PIP2 depletion. FRAP experiments showed no evidence of oligomer trapping within obstacle-enriched regions. Size estimates derived from fluorescence contrast analysis were not quantitatively reliable, but they qualitatively supported a shift toward smaller oligomers upon PIP2 depletion. Overall, the results suggest that larger SERT oligomers are excluded from diffusional barriers, while smaller species remain mobile. The observed shift toward larger mobile oligomers under PIP2 depletion indicates a redistribution within the accessible oligomer population. These findings support the idea that oligomerization may contribute to the regulation of SERT mobility and spatial organization in the plasma membrane and provide a basis for future investigations.