Single-molecule analysis of the T cell receptor and the zeta-chain at the plasma membrane of T lymphocytes

Abstract

Das Immunsystem beschützt Organismen durch eine Vielzahl verschiedener Mechanismen. Die darin vorkommenden T-Lymphozyten, mit den jeweiligen T-Zell-Rezeptoren (TCR) tragen hierbei eine schwerwiegende Rolle durch das Binden von Peptiden und dem Einleiten der Immunantwort. Obwohl lange bekannt ist, dass der TCR, mit den ihm assoziierten Proteinen CD3 und Zeta, diese Aufgabe erfüllt, existieren weiterhin einige grundlegenden Fragen. Die Zeta-Kette stellt einen wichtigen Bindungspartner des TCR dar, und ermöglicht den Zusammenbau des TCR/CD3/-Komplexes und dessen Transport in die Zellmembran. Auch innerhalb der Immunantwort übernimmt die Zeta-Kette wichtige Aufgaben. Die meisten frühen Studien des TCR/CD3/Zeta-Komplexes basieren auf indirekten, biochemischen Methoden, wie der Co-Immunopräzipitation. Große Fortschritte in der Lichtmikroskopie ermöglichten die Analyse einzelner Moleküle und dadurch direktere Beobachtungen. In der vorliegenden Arbeit wurden Einzel-Molekül-Tracking Experimente durchgeführt, um Information über die Diffusion einiger am Komplex beteiligter Proteine (TCR-Beta und Zeta) zu erhalten. Weiters wurde 2-Farb PALM durchgeführt, um Informationen über eventuelles Clustering von TCR-Beta und Zeta in ruhenden und aktivierten primären Maus-T-Zellen zu erhalten. Die in der Analyse verwendeten Algorithmen zur Lokalisierung und zum Tracken einzelner Signale wurden evaluiert und als adäquat zur Anwendung an den vorliegenden Bildersequenzen befunden. Die Fähigkeit der verwendeten T-Lymphozyten, durch pMHC-Bindung Ca2+-Fluss zu initialisieren, wurde überprüft und bestätigt. Überraschenderweise offenbarte die Diffusionsanalyse Unterschiede in der Diffusion von TCR -Beta und Zeta. Dies weist auf die mögliche Existenz von TCR/CD3-Komplex unabhängigem, Membran-gebundenem Zeta, und eine weniger stabile Assoziation des TCR-CD3/Zeta-Komplexes als bisher angenommen hin. Weiters wurden Hinweise auf Clustering der beiden untersuchten Proteine gefunden. Während dieser Cluster-Analyse wurden bedeutsame Nachteile der Verwendung von PALM zu quantitativen Analysen, v.a. durch die Ripley's K Funktion untersucht.

The immune system protects an organism in a multitude of different ways. The T lymphocytes, with their respective T Cell Receptor (TCR), bear a grave role by binding foreign antigens and initiating the adaptive immune response. Even though the TCR and its associated proteins, CD3 and zeta, are long known to execute this vital task, much remains to be elucidated. The chain represents an essential part of the complex for assembly and membrane association, as well as for accurate signal initiation. Most studies on the TCR/CD3/zeta complex were made by rather indirect methods, such as co-immunoprecipitation. However, with the recent progress made in light microscopy, enabling single molecule observations, more direct experiments can be done. In this work, single molecule tracking experiments were performed to get information on the diffusional behaviour of some of the involved proteins, i.e. TCRbeta and zeta. Furthermore, two-color PALM was used to examine possible clustering of TCR beta and zeta in resting and stimulated primary mouse T cells. The utilized algorithms for localization and tracking were evaluated before use and found to be adequate for densities and SNRs in the range of the actual experiments. The potency of the used murine T cells to induce Ca2+ flux by pMHC binding was confi rmed. Interestingly, the diffusional behaviour of zeta was found to differ from the one of TCRbeta , highlighting the possibility of TCR/CD3-free zeta within the membrane. These diffusional differences between zeta and TCRbeta indicate less stable interactions within the TCR/CD3/zeta complex, than identi fied by biochemical methods. Furthermore, hints on spatial clustering of both proteins were identifi ed. However, crucial pit-falls within a commonly used data analysis on PALM images, i.e. Ripley's K function, were shown.