Vorbereitung biologischer Proben für Elektronen-Mikroskopie : Vergleich zwischen chemischer Fixierung und Hoch-Druck Frieren

Abstract

Zur Anschauung ultrastruktureller Elemente in biologischen Materialien ist Elektronenmikroskopie unabdingbar. Die Proben müssen richtig präpariert werden, um dem Vakuum und der Strahlung innerhalb eines Elektronenmikroskopes widerstehen zu können. Der klassischste Ansatz ist eine chemische Fixierung. Fixative erhalten die Zellstruktur indem sie Verbindungen zwischen Proteinen und Lipiden herstellen und Schwermetalle werden zur Kontraststeigerung eingesetzt. Es ist eine einfache und kosteneffektive Prozedur die dem Hochdruck Frieren gegenüber steht. Während des Gefriervorgangs mittels flüssigem Stickstoffs wird ein extrem hoher Druck ausgeübt um die Ausdehnung von Eiskristallen und somit eine Beschädigung der Probe zu verhindern. Die Probe wird anschließend einer Gefriersubstitution unterzogen bei der gefrorenes Wasser durch flüssige Lösungsmittel und Fixative ersetzt und langsam auf 0°C erwärmt wird. Die Wahl der Fixierungsmethode hängt von der Probe und der zu untersuchenden Struktur ab. Gewebe und Zellkulturen wurden mittels beider Methoden präpariert und die Qualität der Ultrastruktur verglichen. In hochdruck-gefrorenen Proben waren Membranen deutlich glatter und Mitochondrien besser erhalten. Neuronale Komponenten waren in chemisch xierten Proben besser fixiert, allerdings traten Fehler in der Einbettung häuger auf.

Electron microscopy (EM) is indispensable when it comes to the analysis of ultrastructural elements of biological material. However, the right preparation is necessary so that biological samples withstand vacuum and radiation inside an electron microscope without changes in ultrastructure. Chemical fixation can be considered the most classical approach. Fixatives are used to crosslink proteins as well as lipids to retain the original structure and stains are added for increased contrast. It is a relatively easy and cost effective procedure. On the other hand, high-pressure freezing offers a more physical approach to structural preservation. Exertion of a very high pressure during rapid freezing in liquid nitrogen hinders the expansion of ice crystals and thus the damage to cellular material. The sample subsequently undergoes a process called freeze substitution in which frozen water is replaced by liquid solvents and fixatives while slowly warming up to 0°C. The optimal method of preparation varies by sample and structure of interest. To establish a comparison, tissue and cell cultures from various organisms were prepared and the quality of the ultrastructure compared. High-pressure frozen samples typically showed smoother membranes and better preservation of mitochondria. Chemically fixed samples demonstrated better fixation of neuronal components but a higher likelihood of faulty resin infiltration.