3D construction of artificial extracellular matrix hydrogels by two-photon-induced polymerization

Abstract

Hydrogele werden zurzeit intensiv für den Einsatz als weiche Biomaterialien für Zellkulturen und Geweberegeneration untersucht. Besonderes Interesse hat das Designen von 3D Hydrogelen, welche die essentiellen Eigenschaften der extrazellulären Matrix (ECM) widerspiegeln, geweckt. Eine Methode, um solche biomimetischen Hydrogele herzustellen, ist die Zwei-Photonen-Polymerisation (2PP), welche es erlaubt, 3D Konstruktionen von Hydrogelen mit benutzerdefinierten Architekturen im µm-Bereich zu generieren. Jedoch ist die biologische Anwendung dieser Methode noch limitiert aufgrund des Fehlens geeigneter Hydrogel-Precursor, die sowohl biokompatibel als auch hochreaktiv im Hinblick auf die 2PP sind. Die vorliegende Arbeit zielt darauf ab, neue Hydrogel-Precursor zu entwickeln, welche zugleich biokompatibel, bioabbaubar und photopolymerisierbar sind und welche sich zur 3D Strukturierung von künstlichen ECM Hydrogelen mittels 2PP eignen. In dieser Arbeit wurden sowohl natürliche (Gelatine und Hyaluronsäure) als auch synthetische Materialien (Polyethylenglykol, PEG) mit wenig toxischen Vinylestergruppen funktionalisiert. Die Untersuchung auf Biokompatibilität zeigte, dass diese Precursor eine signifikant geringere Zytotoxizität aufweisen, als ihre (Meth)acrylat-Analoga. Obwohl sich ihre Reaktivität als nicht hoch genug für 2PP herausstellte, konnte gezeigt werden, dass die Thiol-En-Chemie die Reaktivität effektiv erhöhen kann. Durch verschiedene Thiol/En-Verhältnisse bzw. durch Variation des Makromer-Gehalts sind Hydrogele mit variablen Eigenschaften zugänglich. Diese optimierten Formulierungen erlaubten die 2PP-Herstellung von 3D biomimetischen Hydrogelen bei einer Schreibgeschwindigkeit von bis zu 50 mm/s. Um die Reaktivität weiter zu erhöhen, wurde Polyvinylalkohol als Polymerrückgrad mit Norbornen-Gruppen modifiziert und so ein neuer Hydrogel-Precursor entwickelt. Die Zytotoxizität dieses Materials stellte sich als vernachlässigbar heraus, während die Reaktivität hinsichtlich Thiol-En-Polymerisation höher war als beim Kontrollmaterial (PEG-Diacrylat). Mechanische Eigenschaften dieser Hydrogele (Elastizitätsmodul: 0,5-400 kPa) lagen im Bereich verschiedener weicher Gewebe. Diese stabile Thiol-Norbornen-Chemie erlaubte die 2PP-Herstellung von komplexen Hydrogel-Konstrukten mit einer Schreibgeschwindigkeit von bis zu 100 mm/s. Als neues Konzept wurde letztendlich die "Zwei-Photonen Zell-Einkapselung" untersucht, um zu testen, ob sich lebende Zellen in 3D Hydrogelen mittels 2PP einschließen lassen. Es stellte sich heraus, dass die meisten Zellen, welche der Laserbestrahlung ausgesetzt wurden, nach der Einkapselung abgestorben waren.

Hydrogels are extensively explored as soft biomaterials for cell culture and tissue regeneration. In particular, designing 3D hydrogels that closely mimic extracellular matrix (ECM) functions has become increasingly important. One approach to create ECM-mimetic hydrogels is two-photon polymerization (2PP), which allows 3D construction of hydrogels with user-dictated µm-scale architectures. However, biological application of this method is limited by the lack of appropriate hydrogel precursors that are biocompatible and highly reactive for 2PP. This thesis aimed to develop novel hydrogel precursors that are biocompatible, biodegradable and photopolymerizable for fast 3D fabrication of artificial ECM hydrogels via 2PP. Specifically, both naturally-derived (gelatin and hyaluronic acid) and synthetic materials (polyethylene glycol, PEG) were functionalized with low toxic vinyl ester groups. Biocompatibility assay revealed that these precursors exhibited significantly lower cytotoxicity than their (meth)acrylates references. Although their reactivities were not sufficient for 2PP, it was proved that thiol-ene chemistry could effectively improve their reactivity. Hydrogels with tunable properties were accessible by either changing the thiol to ene ratio or macromer content. These optimized formulations enabled 2PP-fabrication of 3D biomimetic hydrogels at a writing speed up to 50 mm/s. To further improve the reactivity, polyvinyl alcohol with pendant norbornene groups was developed as a novel hydrogel precursor. Cytotoxicity of this material on fibroblasts was found to be negligible while its reactivity towards thiol-ene polymerization was even higher than that of a PEG diacrylates control. Mechanical properties of these hydrogels (elastic moduli: 0.5-400 kPa) could match various soft tissues. The robust thiol-norbornene chemistry enabled 2PP-fabrication of complex hydrogel constructs at a writing speed up to 100 mm/s. A novel concept "Two-photon Cell-Encapsulation" was finally explored to test the feasibility of encapsulating living cells within 3D hydrogels via 2PP. It was found that most cells exposed to laser irradiation were dead after encapsulation. Control experiments revealed that laser irradiation alone (no photoinitiator) did not induce cell death. Molecular mechanisms to cell damage during 2PP-encapsulation were proposed from two aspects: photoinitiator-derived radicals and reactive oxygen species. Collectively, this thesis developed novel hydrogel precursors for fast 2PP-fabrication of biocompatible hydrogel constructs. These hydrogels may help to better understand how cells receive information from and interact with the ECM microenvironment. The knowledge can be exploited for engineering complex tissues and designing novel strategies for tissue regeneration.