Wohlschlager, L. (2017). Engineering a biocatalyst for carbenoid C-H insertion [Diploma Thesis, Technische Universität Wien; California Institute of Technology]. reposiTUm. http://hdl.handle.net/20.500.12708/78575
Für gewöhnlich beruht die Synthese komplexer Moleküle auf der Einführung sowie Umwandlung funktioneller Gruppen. Nicht selten sind dabei mehrstufige Prozesse nötig, die oftmals unter harschen Reaktionsbedingungen ablaufen und Abfallstoffe erzeugen. Eine neue Strategie - C-H Funktionalisierung - verfolgt das Ziel, C-C Bindungen zwischen einfachen, kommerziell verfügbaren Vorläufersubstanzen zu bilden, indem die Reaktion direkt an einer der, in organischen Molekülen zahlreich vorhandenen, C-H Bindungen durchgeführt wird. Diese Herangehensweise könnte die Art, wie organische Synthese konzipiert wird, revolutionieren und uns Wege zu neuen, bisher synthetisch schwer oder nicht zugänglichen Produkten eröffnen. Die größten Schwierigkeiten, die dabei auftreten, sind die Stärke der meisten C-H Bindungen sowie ihr ubiquitäres Vorkommen in so gut wie allen organischen Verbindungen. Es ist bekannt, dass einige Enzyme in der Lage sind, C-H Bindung selektiv zu spalten. Somit liegt nahe, diese Eigenschaften von Enzymen zu nutzen und durch Erweiterung des katalytischen Repertoires Limitierungen zu überwinden. In dieser Arbeit wird gezeigt, wie ein Cytochrom P450BM3 dahingehend verändert wird, dass es eine intermolekulare Insertion einer Carbenoid-Spezies in eine C-H Bindung katalysieren kann. Dies ist eine Reaktion, die in der Natur bisher noch nicht beobachtet wurde. Diverse Methoden der gerichteten Evolution wurden angewendet um die Sequenz des Proteins zu modifizieren und einen Biokatalysator zu entwickeln, der die gewünschte Transformation in vivo und in vitro durchführt.
The synthesis of complex molecules usually relies on the introduction and transformation of functional groups and quite often involves multiple-step processes, harsh reaction conditions and accumulation of waste. A new strategy - C-H functionalization - pursues the formation of new C-C bonds between simple precursor compounds by performing reactions directly at C-H bonds that are present in every organic molecule. This approach can lead to a more direct and straightforward way of realizing organic synthesis and also opens up a complete new spectrum of synthetically possible products. The major challenges of this chemistry are the strength and ubiquity of C-H bonds which makes it difficult to specifically target and transform them. Since some enzymes are known for their capability of breaking C-H bonds selectively, we hypothesized that we can make use of their features to overcome those limitations. In this work, we show that an enzyme - a cytochrome P450BM3 - can be engineered to catalyze an intermolecular carbenoid C-H insertion, a reaction not yet found in nature. Directed evolution methods were applied to modify the sequence of the protein and resulted in a biocatalyst capable of performing the non-natural transformation both in E. coli whole cells as well as in vitro.
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Zusammenfassung in deutscher Sprache Abweichender Titel nach Übersetzung der Verfasserin/des Verfassers