Investigation of the laccase-mediated oxidation of alcohols - model compounds for starch oxidation

Abstract

Laccases are redox enzymes that have been a subject of interest in academia and industry for several decades because they provide a green alternative to established purely chemical alcohol oxidation protocols. However, laccases exhibit relatively low redox potentials (350-800 mV) compared to other redox-active enzymes (>1000 mV), limiting their substrate scope for direct alcohol oxidation to phenolic alcohols. But, if mediators are used in combination with laccases, the oxidative power of the system can be increased. Mediators are organic compounds that can be readily oxidized and reduced and act as electron shuttles between enzymes and substrates. Thus, the substrate scope of laccases is widened as a mediator can oxidize a substrate in a different mechanism from the enzyme itself. Today, many mediators are known bearing different core structures and functional groups, enabling the oxidation of various non-phenolic moieties as primary and secondary benzylic, linear and cyclic aliphatic alcohols. Furthermore, the choice of substrate can influence the outcome of the reaction heavily, as lipophilic alcohols (e.g. benzyl alcohols) are reported to only give their corresponding aldehydes, while the higher the polarity of the substrate, the more likely overoxidation to acids is observed. Naturally, laccase-mediator systems are highly complex as many parameters influence their performance: choice of laccase and its concentration, selection of mediator and its concentration, pH, oxygen source, and substrate and its concentration. Within our efforts to achieve laccase-mediated starch oxidation towards aldehyde starch, we discovered a lack of a thorough investigation of the many parameters of this multivariate system. Therefore, we conducted an in-depth study of the laccase-mediated oxidation of alcohols using three model substrates for starch oxidation of increasing complexity. In this light, first, we focused on our model system, utilizing anis alcohol as substrate, to be fast and easy to analyze to reduce the complexity of the system before focusing on more sophisticated substrates. Within our model system, we conducted time-resolved screening of ten laccases and thirteen mediators via GC-FID analysis. We can report that the most efficient laccases are high redox potential laccases, e.g., laccase from Trametes versicolor. Moreover, the highest performing mediators are 2-hydroxy-2-azaadamantane (AZADOL), 4‐(2‐methoxyethoxy)-2,2,6,6-tetramethylpiperidinyl-1-oxyl (MeO-EtO-TEMPO) and 4‐Methoxy‐2,2,6,6-tetramethylpiperidinyloxyl (methoxy-TEMPO), achieving conversions of 100% after 5h reaction time. We further conducted an optimization of the laccase- and mediator concentration. The laccase loading could be reduced to 8% of the original concentration while preserving a similar reactivity, and we found the optimal mediator loading to be 0.1-0.2 equiv. with respect to the substrate. Additionally, we investigated the role of oxygen. We found that delivery of oxygen is a non-limiting factor of the laccase mediator system under our conditions, as O2 from air leads to the same conversions as pure oxygen.The second model substate was diacetone fructose, a sterically hindered secondary alcohol. We were primarily interested in the capability of our mediators to oxidize the hindered alcohol, so we carried out a mediator screening via GC-FID. We observed that among the best performing mediators of the previous anis alcohol system AZADOL is the only mediator capable of the oxidation of diacetone fructose. We concluded that TEMPO and derivatives are too sterically hindered to react with diacetone fructose, and N-hydroxy compound 1-hydroxy benzotriazole (HBT) undergoes an unfavorable oxidation pathway for non-benzylic substrates.In the third, most complicated model system, our main interest lay in assessing the overoxidation we experienced in starch oxidation. We chose α-methyl glucoside as our model substrate, as it shares critical structural features with starch, most notably the high polarity, leading to overoxidation, and the primary alcohol in position 6. We screened five mediators (AZADO, methoxy-TEMPO, 4-Acetamido-2,2,6,6-tetramethylpiperidine 1-oxyl (Acetamido-TEMPO), and HBT) that stood out in the screenings above with this substrate using 1H-NMR for quantification of the aldehyde and alcohol contents as well as a colorimetric assay for the calculation of the acid concentration. We report that AZADO and methoxy-TEMPO are the most efficient mediators in this system, achieving conversions to ~12% aldehyde and ~30% acid. We could even isolate the dialdoside from laccase-mediated oxidation with an 11% yield, which is a precedent, as the sensitive dialdoside were seen as reactive intermediates towards the α-methyl glucuronate.The obtained results allowed substantial advancements in the starch oxidation project by either the direct translation of the results of this thesis or further hypothesis-driven investigations based on findings of this work.

Laccasen sind Redoxenzyme, die seit mehreren Jahrzehnten sowohl in der Wissenschaft als auch in der Industrie von Interesse sind, da sie eine grüne Alternative zu etablierten, rein chemischen Protokollen zur Oxidation von Alkoholen darstellen. Allerdings weisen Laccasen im Vergleich zu anderen redoxaktiven Enzymen (> 1000 mV) eher niedrige Redoxpotentiale (350–800 mV) auf, was die Anzahl an Substraten, die so direkt oxidierbar sind, auf Phenole einschränkt. Werden Laccasen jedoch in Kombination mit Mediatoren verwendet, so kann die Oxidationskraft des Systems erhöht werden. Mediatoren sind organische Verbindungen, die leicht oxidiert und reduziert werden können. Sie dienen als Elektronenshuttle zwischen Enzym und Substrat. Durch die Einführung eines Mediators werden neue, dem Enzym alleine nicht zugängliche, mechanistische Wege möglich, das Substrat zu oxidieren. Das bewirkt, dass andere Substarte als nur phenolische Alkohole oxidiert werden können. Heutzutage ist eine Vielzahl an Mediatoren bekannt, die unterschiedliche Kernstrukturen und funktionelle Gruppen tragen, die die Oxidation verschiedener nicht-phenolischer Alkohole (primäre, sekundäre, benzylische, lineare und cyclische aliphatische Alkohole) ermöglichen. Die Wahl des Substrats kann das Ergebnis der Reaktion beeinflussen, da lipophile Alkohole (z. B. Benzylalkohole) nur ihre entsprechenden Aldehyde ergeben, während die Überoxidation zu den Säuren bei polareren Substraten vorkommt.Laccase-Mediator-Systeme sind komplex, da sie von vielen Parametern beeinflusst werden: Die Wahl der Laccase und ihrer Konzentration, die Wahl des Mediators und seiner Konzentration, der pH-Wert, die Sauerstoffquelle und das Substrat und seiner Konzentration. Im Zuge der Erforschung der Oxidation von Stärke zu Aldehydstärke über ein Laccase-Mediatorsystem, stellten wir fest, dass es an einer grundlegenden Untersuchung der zahlreichen Parameter dieses multivariaten Systems mangelte. Daher wurde eine eingehende Untersuchung der Oxidation von Alkoholen mittels Laccase-Mediator Systemen unter Verwendung dreier Modellsubstrate zunehmender Komplexität durchgeführt. In unserem ersten Modellsystem, in welchen Anisalkohol als Substrat fungiert, legten wir besonderen Fokus auf eine schnelle Analytik, um die Komplexität des Systems zu reduzieren, bevor wir uns auf die anspruchsvolleren Substrate analysieren würden. Wir führten ein zeitaufgelöstes Screening von zehn Laccasen und dreizehn Mediatoren über GC-FID durch. Die effizientesten Laccasen in diesem Screening hatten ein hohes Redoxpotential, wie z. B.: Laccase von Trametes versicolor. Darüber hinaus sind die leistungsstärksten Mediatoren 2‐Hydroxy-2-azaadamantan (AZADOL), 4‐(2‐Methoxyethoxy)-2,2,6,6-tetramethylpiperidinyl-1-oxyl (MeO-EtO-TEMPO) und 4‐Methoxy‐2,2,6,6-Tetramethylpiperidinyloxyl (methoxy-TEMPO), welche nach 5h Reaktionszeit Umsätze von 100 % erzielen konnten. Weiterhin wurde eine Optimierung der Laccase- und Mediatorkonzentration durchgeführt. Die Laccase-Beladung konnte auf 8 % der ursprünglichen Konzentration reduziert werden, während eine vergleichbare Reaktivität beibehalten wurde. Zusätzlich fanden wir heraus, dass die optimale Mediatorladung 0,1–0,2 Äquivalente ausgehend von der Substratkonzentration beträgt. Weiters untersuchten wir die Rolle von Sauerstoff, wobei wir herausfanden, dieser ein nicht limitierender Faktor des Laccase-Mediatorsystems ist, da O2 aus der Luft zu denselben Umwandlungen führt wie reiner Sauerstoff. Das zweite Modellsubstrat war Diacetonfructose, ein sterisch gehinderter sekundärer Alkohol. Unser Interesse hierbei lag hauptsächlich an der Frage, welcher unserer Mediatoren in der Lage wäre, diesen sterisch gehinderten Alkohol zu oxidieren. Daher führten ein Mediator-Screening mittels GC-FID durch. AZADOL stellte sich dabei als einziger Mediator heraus, der zur Oxidation von Diacetonfructose fähig ist. Wir kamen zu dem Schluss, dass TEMPO und Derivate selbst zu sterisch gehindert sind, um mit Diacetonfructose zu reagieren, und dass die N-Hydroxyverbindung 1‐Hydroxybenzotriazol (HBT) einen ungünstigen Oxidationsweg für nicht-benzylische Substrate durchläuft. Im Zuge unseres dritten, kompliziertesten Modellsystem lag unser Hauptinteresse in der Beurteilung der Überoxidation zur Säure, die wir auch bei der Stärkeoxidation beobachten konnten. Wir wählten das Modellsubstrat α-Methylglykosid aus, da es wichtige Strukturmerkmale mit Stärke teilt, vor allem die hohe Polarität, die zu Überoxidation führt, und den primären Alkohol in Position 6. Fünf Mediatoren (AZADO, methoxy-TEMPO, 4- Acetamido-2,2,6,6-tetramethylpiperidin-1-oxyl (Acetamido‐TEMPO) und HBT) wurden mit diesem Substrat getested. Die Quantifizierung erfolgte mittels 1H‐NMR, sowie einem kolorimetrischen Assay. AZADO und methoxy-TEMPO stellten sich als die effizientesten Mediatoren in diesem System heraus. Umwandlungen zu ~12 % Aldehyd und ~30 % Säure konnten erreicht werden. Weiters isolierten wir das Dialdosid aus einer Laccase-Mediator Oxidation mit einer Ausbeute von 11 %, obwohl diese Stoffklasse laut Literatur in solchen enzymatischen Prozessen als nicht isolierbares Zwischenprodukt zu dem α-Methylglucuronat angesehen wurden.Die gesammelten Ergebnisse ermöglichten uns wesentliche Fortschritte im Stärkeoxidationsprojekt, entweder durch die direkte Umsetzung der Ergebnisse dieser Arbeit oder durch weitere hypothesengetriebene Untersuchungen, die auf den Erkenntnissen dieser Arbeit basieren.