Title: Analyzing spatial organization and clustering of the T cell receptor
Other Titles: Analyse der räumlichen Anordnung sowie des Clusterings des T Zell Rezeptors
Language: English
Authors: Reutterer, Bernd 
Qualification level: Diploma
Keywords: endoplasmic reticulum; superresolution microscopy; T cell; protein cluster; T cell receptor
Advisor: Schütz, Gerhard 
Assisting Advisor: Baumgart, Florian 
Issue Date: 2018
Number of Pages: 57
Qualification level: Diploma
Abstract: 
Die räumliche Verteilung von Proteinen und Lipiden der Plasmamembran ist von großem wissenschaftlichem Interesse, da diese für die Signalweiterleitung innerhalb der Zelle als bedeutend gilt. Ein bekanntes Beispiel von struktureller Organisation von Membranproteinen ist die Formation von Mikroclustern und der Immunologischen Synapse in Folge der Aktivierung von T Zellen. Hochauflösende Messmethoden in der Mikroskopie wie PALM oder (d)STORM zeigten, dass Membranproteine, wie auch der T Zell Rezeptor, in noch kleineren Clustern im Nanometerbereich organsiert sind. Jüngste Erkenntnisse über Artefakte, die beim Messen mit solchen Methoden auftreten, wecken jedoch Zweifel an diesen Ergebnissen. Die verwendeten Messmethoden beruhen auf dem Blinken von Fluorophoren, was dazu führen kann, dass ein und dasselbe Fluorophor öfters detektiert und als Cluster interpretiert wird. In dieser Arbeit wird eine Methode, die von diesem Effekt nicht betroffen ist erstmals angewendet. Bei dieser Methode wird ein Protein mit zwei verschiedenen Farbstoffen markiert und die Distanzen zwischen einer Lokalisation und dem nächsten Nachbaren im zweiten Farbkanal berechnet. Durch einen Unterschied zwischen den Verteilungen der Distanzen im Fall eines geclusterten Moleküls und einer Zufallsverteilung der Proteine kann man Cluster detektieren. In dieser Arbeit wurde diese Methode zur Untersuchung der räumlichen Organisation des T Zell Rezeptors in aktivierten und nicht-aktivierten Maus-T Zellen verwendet. Die Ergebnisse weisen einen klaren Unterschied für nicht-aktivierte und aktivierte T Zellen auf. Des Weiteren wurde untersucht, ob die räumliche Anordnung von T Zell Rezeptor Microclustern in der T Zell Plasmamembran von der Position des Endoplasmatischen Retikulums abhängig sind, da dieses laut Literatur nach der Aktivierung einer T Zelle and die Plasmamembran bindet um einen Ca2+ Einstrom in die Zelle zu ermöglichen.

The spatial organization of proteins and lipids within the cell membrane is of high interest as it is thought to regulate cell signaling. The formation of T cell receptor (TCR) microclusters and the immunological synapse upon T cell activation was key to realize that the orchestrated spatial rearrangement of T cell signaling proteins was important for T cell function. After development of single molecule localization microscopy methods like PALM and (d)STORM, results suggesting the nanoscale clustering of membrane proteins were published. Importantly, nanoclusters of the TCR were found even in non-activated T cells. However, recent findings indicate that fluorophore blinking could lead to overcounting and therefore to the erroneous detection of (non-existing) nanocluster. This thesis applies a novel experimental strategy to overcome these blinking effects. The method relies on the principle of labeling the same protein with two different fluorophores. Clustered and randomly distributed proteins can be discriminated by characteristically different distance distributions of the localizations between the two color channel. The technique was used in activated and nonactivated primary mouse T cells to investigate the spatial organization of the T cell receptor. Results show a clear differennce for non-activated and activated T cells. In addition to investigating the nanoscale organization of the TCR, the role of intracellular structures (e.g. endoplasmic reticulum (ER)) in influencing the spatial distribution of TCR microclusters upon T cells activation was addressed. The ER is known to bind to the plasma membrane upon T cell activation to facilitate the inflow of Ca2+ from the extracellular space into the cell. Two color fluorescence imaging was used to test whether the spatial organization of the TCR depends on the position of ER-plasma membrane junctions.
URI: https://resolver.obvsg.at/urn:nbn:at:at-ubtuw:1-118865
http://hdl.handle.net/20.500.12708/7923
Library ID: AC15219058
Organisation: E134 - Institut für Angewandte Physik 
Publication Type: Thesis
Hochschulschrift
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