Citation:
Mika, J. K. (2015). Universelle mikroelektronische Messplattform zur in vitro Untersuchung von Aktionspotentialen von sich regenerierenden Neuriten unter Einfluss des Neurotrophins “Nerve Growth Factor ß” [Dissertation, Technische Universität Wien]. reposiTUm. http://hdl.handle.net/20.500.12708/79776
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Publication Type:
Thesis - Dissertation
en
Language:
German
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Date (published):
2015
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Number of Pages:
225
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Keywords:
Mikrofluidik; Mikroelektrodenarray; Nervenwachstumsfaktor; Aktionspotential; Nervenregeneration; Neurotrophine
de
microfluidic; microelectrode array; nerve growth factor; action potential; nerve regeneration; neurotrophins
en
Abstract:
Mit dem Beginn der Ära der Mikroelektronik und der stetigen Miniaturisierung der Funktionseinheiten wurden ihre Errungenschaften und Anwendungsmöglichkeiten auch von anderen Disziplinen, wie der Neurobiologie, entdeckt. In jüngster Zeit wurde die Mikrostrukturierung auch für Forschungszwecke, wie etwa für die Untersuchung des Einflusses von Wachstumsfaktoren (Neurotrophinen) auf die Regeneration von Nervenzellen verwendet. Zur Erforschung von regenerierendem Nervengewebe gibt es derzeit zwei etablierte Methoden: (i) optische Methoden, wie die Mikroskopie, die eine lange Kultivierungsdauer der Zellen und eine aufwändige Analyse erfordern, oder aber die (ii) elektrophysiologischen Methoden, wie die Patch-Clamp Technik, die eine invasive Methode zur Messung des Stroms durch Ionenkanäle in der Zellmembran darstellt. Mit beiden etablierten Methoden kann nur ein kleiner Bereich, nämlich einzelne zelluläre Ionenkanäle, untersucht werden, was einen Nachteil bei der gleichzeitigen Untersuchung von mehreren regenerierenden Neuronen darstellt. Mangels einer Untersuchungsmethode gibt es bisher keine Information über die funktionell wichtige, elektrische Aktivität in Form von Aktionspotentialen während der Regeneration der Nervenzellenfortsätze (Neuriten). In der vorliegenden Arbeit wurde eine mikroelektronische Messplattform zur in vitro Untersuchung von Aktionspotentialen von sich regenerierenden Neuriten unter Einfluss des Neurotrophins -Nerve Growth Factor ß- (ß-NGF) entwickelt. Die in dieser Arbeit vorgestellte mikroelektronische Messplattform wurde, mit dem Neuriten-Isolations-Mikroelektrodenarray (NI-MEA) als zentralem Bestandteil, entwickelt, um (i) Nervenzellen über mehrere Wochen in einer funktionalen Mikrostruktur in vitro kultivieren zu können, (ii) deren sich regenerierenden Neuriten mit Hilfe von Mikrokanälen zu separieren und (iii) elektrophysiologische Signale an den Neuriten aufzunehmen und sie mit optischen Methoden zu korrelieren. Das NI-MEA besteht aus einem Neuriten-Isolations-Aufsatz (NI-Aufsatz) aus PDMS zur physischen Trennung der sich regenerierenden Neuriten und einem Mikroelektrodenarray (MEA) zur elektrophysiologischen Messung. Der NI-Aufsatz enthält zwei Makrokanäle, die über mehrere Mikrokanäle miteinander verbunden sind. Das MEA besteht aus einem Glassubstrat, auf dem 60 Mikroelektroden aufgebracht sind. Beide Teile werden so miteinander assembliert, dass sich die Mikroelektroden des MEAs innerhalb der Mikrokanäle des NI-Aufsatzes befinden. Zur Kultivierung werden 10.000 vereinzelte Nervenzellen ohne Neuriten in einen der beiden Makrokanäle ausgesät. Der geringe Querschnitt der Mikrokanäle verhindert das Eindringen der ganzen Nervenzellen in diese Kanäle. Bilden die Nervenzellen in den folgenden Tagen Fortsätze aus, so können nur diese in die Mikrokanäle einwachsen. Von den Neuriten können elektrophysiologische Signale mit Mikroelektroden aufgenommen werden. Um aus den aufgenommenen Signalen die neuronal generierten Aktionspotentiale erkennen zu können, wurde ein eigenes Detektionsprogramm mit zwei unterschiedlichen Detektionsverfahren entwickelt. Zur optischen Verifizierung der elektrophysiologischen Ergebnisse wurde eine Methode zur immunzytologischen Färbung der sich in den mikrofluidischen Strukturen befindlichen Nervenzellen entwickelt. Zur Überprüfung der Leistungsfähigkeit der mikroelektronischen Messplattform wurden drei Experimente mit bereits ausdifferenzierten Neuronen des oberen Halsganglions von P5 WT Mäusen mit unterschiedlichen NI-MEA-Konfigurationen durchgeführt und ausgewertet. Im Ergebnis konnte gezeigt werden, dass die Zellen im NI-MEA über einen Zeitraum von mindestens drei Wochen kultiviert werden können und dabei Neuriten ausbilden, die durch die Mikrokanäle und somit über die Mikroelektroden, die sich in den Kanälen befinden, wachsen. Weiters wurde gezeigt, dass elektrophysiologische Signale von den Mikroelektroden aufgenommen und daraus mit Hilfe des entwickelten Detektionsprogramms Aktionspotentiale neuronalen Ursprungs extrahiert werden können. Eine Sensitivitätsanalyse der Messplattform erfolgt durch weitere Analysen der Aktionspotentiale, aus denen die elektrische Ausbreitungsgeschwindigkeit entlang der Neuriten sowie das Inter-Spike-Intervall Diagramm für jede Elektrode bestimmt werden konnten. Das -proof-of-concept- wurde erfolgreich durch die Kultivierung von SCG-Nervenzellen unter drei unterschiedlichen Konzentrationen von ß-NGF über einen Zeitraum von zwei Wochen erbracht. Dabei wurden die unterschiedlichen Konzentrationen im Medium, die zu unterschiedlich schnellem Wachstum der Neuriten führten, durch Messungen mit der Messplattform nachgewiesen. Die Ergebnisse dieser Arbeit belegen, dass mit der entwickelten Messplattform mit dem NI MEA als zentralem Bestandteil eine elektrophysiologische Verfolgung der Entwicklung regenerierender Neuriten unter Einfluss des Neurotrophins ß-NGF durch die Untersuchung der Aktionspotentiale über einen Zeitraum von zwei Wochen möglich ist. Das legt den Schluss nahe, dass auch beliebige andere Wachstumsfaktoren aber auch Medikamente und Toxine untersucht werden können. Der Neurobiologie steht somit eine neue, universelle mikroelektronische Messplattform zur Verfügung, um die Eignung unterschiedlicher Stoffe, die auf das Wachstum von Neuriten einwirken, zu erforschen.
de
Since the emergence of microelectronics and of continuous miniaturization of functional units its advantages have also been adopted by other disciplines such as neurobiology. Recently, micro-structuring was also employed for research purposes such as studying the influence of biochemical growth factors (e.g. neurotrophins) on the regeneration of nerve cells. Currently, two established methods are used for the investigation of nerve tissue regeneration: (i) optical methods such as microscopy, which require a long culturing period of cells and a time-consuming analysis by the operator, and (ii) electrophysiological methods such as the patch-clamp technique, which is an invasive method for measuring the current through ion channels in the cell membrane. With both methods, only a small area, namely individual cellular ion channels, can be examined, which is a severe shortcoming for simultaneous investigation of multiple regenerating neurons. Due to the lack of a suitable examination method, it was impossible to collect electrophysiological information during the regeneration of nerve cell processes (so-called neurites) up to now. This work addresses the need for a platform that can investigate the functionally important electrical activity in terms of action potentials during neurite growth. In the present work a microelectronic measurement platform for in vitro investigation of action potentials of regenerating neurites under the influence of the neurotrophin nerve growth factor ß (ß-NGF) has been developed and tested. This microelectronic measurement platform includes the neurite isolation microelectrode array (NI-MEA) as central part and was developed to (i) culture growing nerve cells in vitro for several weeks in a functional microstructure, (ii) separate regenerating neurites using artificial microchannels, and (iii) record electrophysiological signals from the neurites during growth and to correlate them with optical results. The NI-MEA consists of a neurite-isolation-attachment (NI-attachment) made of PDMS for physical separation of the regenerating neurites and of a microelectrode array (MEA) for electrophysiological measurements of neurites. The NI-attachment includes two macro-channels, which are interconnected via multiple micro-channels. The MEA consists of a glass substrate with 60 applied microelectrodes. Both parts are assembled together so that the microelectrodes of the MEA are within the microchannels of the NI attachment. For cultivation 10,000 single neurons without neurites are seeded in one of the two macro channels of the NI-MEA. The small cross-section of the microchannels prevents the nerve cells from penetration into these channels. If the nerve cells develop processes during the following days, only these processes can grow into the microchannels. In these microchannels electrophysiological signals can be recorded from the neurites with microelectrodes. In order to identify neuronal activity within the recorded signal a detection program with two different detection methods for action potentials has been developed. For visual verification of the electrophysiological results a procedure for immunocytological staining of the nerve cells directly in the microfluidic structures was developed. To verify the performance of the developed microelectronic measurement platform three experiments were carried out and evaluated. All experiments used already differentiated neurons of the superior cervical ganglion of P5 WT mice cultured on NI-MEA platforms with different configurations. Using these in vitro cultures on a NI-MEA, it was shown that the cells in the NI-MEA can be cultivated for a duration of three weeks, thereby forming neurites through the microchannels and which consequently also extended over the microelectrodes, located in the microchannels. Furthermore, it was proven that electrophysiological signals can be recorded. Action potentials from neuronal origin were extracted using the self-developed detection program. A sensitivity analysis of the microelectronic measurement platform was carried out by further analysis of the action potentials. With the obtained data the electrical propagation speed along the neurites as well as a inter-spike interval histogram for each electrode could be determined. The "proof-of-concept" has been successfully demonstrated by cultivating SCG neurons under three different concentrations of ß-NGF over a period of two weeks. The different concentrations in the medium lead to a different growth process of the neurites which was detected by measurements with the measuring platform. Concluding, the capability of the developed measurement platform (with the NI-MEA as central part) for electrophysiological tracking of the development of regenerating neurites enabled to study the influence of ß-NGF over a period of two weeks. This suggests that any other growth factor as well as drugs and toxins can be equally examined with this platform as well. Thus, a new, universal microelectronic measurement platform to study the influence of different substances on the growth of neurites has been made available for neurobiology.
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Abweichender Titel laut Übersetzung der Verfasserin/des Verfassers
Zsfassung in engl. Sprache
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