Citation:
Anderluh, A. (2015). Nanoscopic organization of the human serotonin transporter in living cells [Dissertation, Technische Universität Wien]. reposiTUm. http://hdl.handle.net/20.500.12708/79983
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Publication Type:
Thesis - Dissertation
en
Language:
English
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Date (published):
2015
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Number of Pages:
147
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Keywords:
Einzelmolekülmikroskopie; Serotonin Transporter; Plasma Membran; Oligomerisierung
de
Single molecule microscopy; serotonin transporter; plasma membrane; oligmerization
en
Abstract:
Der Serotonin Transporter (SERT) ist ein präsynaptisch exprimiertes Protein, welches für die Wiederaufnahme des Neurotransmitters Serotonin aus dem synaptischen Spalt verantwortlich ist. Dadurch beendet SERT einerseits die chemische Signalweiterleitung zwischen zwei Neuronen und sorgt andererseits für die Auffüllung der internen Serotonin Lager für die nächste Signalweiterleitung. Die Funktionalität von SERT scheint einen wichtigen Einfluss auf diverse neuropsychiatrische Krankheiten zu haben, wie z.B. Depressionen, Aufmerksamkeitsdefizitsyndrom (ADHS) oder Angsterkrankungen. Durch seine Rolle als Zielprotein diverser Antidepressiva ist SERT in den letzten Jahrzehnten in den Mittelpunkt klinischer Forschung gerückt. Es ist bereits bekannt, dass SERT als Oligomer, also als Komplex aus mehreren einzelnen Transportern in der Membran von Neuronen vorliegt. Über die Rolle der Oligomerisierung und die genaue Größe und Zusammensetzung der Komplexe ist allerdings bis heute wenig bekannt. Die zurzeit vorliegenden Erkenntnisse basieren fast ausschließlich auf in vitro Ensemble Messungen. Diese können jedoch die genaue Komplexgröße sowie den jeweiligen Anteil verschiedener Komplexgrößen in einer etwaigen Mischung nicht bestimmen. Im Zuge meiner hier präsentierten Dissertation habe ich die nanoskopische Organisation von SERT Komplexen in der Plasmamembran von lebenden Zellen evaluiert. Mittels diverser Einzelmolekül-Mikroskopie Methoden, wie z.B. Einzelmolekül-Helligkeitsanalysen, Single particle tracking und hochauflösender Mikroskopie lag mein Fokus hierbei auf dem Oligomerisierungsverhalten und den dabei zugrundeliegenden Mechanismen. Dabei fand ich SERT Agglomerationen von Monomeren bis zumindest Pentamere, die in derselben Zelle koexistieren. Die Komplexe waren in der Plasmamembran über mehrere Minuten stabil, was auf -kinetisches Einfrieren- von bereits andernorts vorgeformten Oligomeren hindeutet. Durch die Evaluierung der Stöchiometrie von gerade exprimierten Transportern im endoplasmatischen Retikulum (ER) konnte ich zeigen, dass SERT Oligomere tatsächlich bereits hier assemblieren und nach ihrer Inserierung in die Plasmamembran in ihrer Komplexgröße fixiert werden. Weitere Untersuchung des dabei zugrundeliegenden Mechanismus zeigte, dass das Phospholipid Phosphoinositol-2-Phosphat (PIP2) verantwortlich für diese Stabilisierung ist. Nach enzymatischem Abbau von PIP2 wurde die Größe der Komplexe signifikant reduziert und sie zeigten stark beschleunigte Interaktionskinetik. In einem weiteren Projekt habe ich eine vergleichende Studie über das Diffusionsverhalten von Proteinen im ER und in der Plasmamembran realisiert. Mittels einer SERT Mutante, welche im ER zurückgehalten wurde, konnte ich deutlich unterschiedliche Proteindynamiken im ER im Vergleich zu SERT an der Plasmamembran zeigen. Im letzten Projekt dieser Dissertation habe ich mittels hochauflösender Mikroskopie die nanoskopische Verteilung von SERT in fixierten Zellen untersucht. Hierbei fand ich SERT in spezifischen Clustern vorliegend, die durch proteinarme Regionen voneinander getrennt sind. Erste Ergebnisse von primären Neuronen deuten auch für endogenen SERT auf ein spezifisches Verteilungsmuster entlang des Axons hin.
de
The serotonin transporter (SERT) is a presynaptically expressed membrane bound protein responsible for the clearance of the neurotransmitter serotonin from the synaptic cleft. It thereby terminates chemical signal transduction in serotonergic neurons and restores sufficient internal serotonin levels for the next signaling event. Functionality of SERT is believed to play an important role in various neuropsychiatric disorders such as depression, attention deficit hyperactivity disorder (ADHD), or anxiety. Therefore, the transporter has gained great attention as a potent target for antidepressant drugs in the past years. SERT is known to exist in an oligomeric configuration in the plasma membrane of neurons. The purpose of the oligomerization and the exact size of the complexes, however, are not understood. Most of the currently available information was obtained in vitro in bulk experiments, which cannot determine the exact size of the complexes and the fractions of the different oligomeric states. In this thesis I have unraveled the nanoscopic organization of SERT complexes in the plasma membrane of living cells. My main focus was to determine the oligomerization behavior and its underlying mechanism using a set of state of the art single molecule microscopy techniques such as single molecule brightness analysis, single particle tracking and super-resolution microscopy. I found a variety of aggregation states of membrane-associated transporters, revealing molecular associations at least up to pentamers and demonstrating the coexistence of different degrees of oligomerization in a single cell. The complexes remained stable over several minutes in the live cell plasma membrane, indicating kinetic trapping of SERT oligomers at the plasma membrane subsequent to an equilibration which occurs at an unknown subcellular organelle. By evaluating the subunit stoichiometry of SERT in the endoplasmic reticulum (ER) I found that the oligomerization is indeed chemically equilibrated at ER membranes; after trafficking to the plasma membrane, the SERT stoichiometry remains fixed. I was able to show that the stabilization of the transporter complexes can be ascribed to the minor phospholipid phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate (PIP2); upon enzymatic depletion of PIP2 the SERT complexes are liberated from kinetic trapping at the plasma membrane and their oligomeric size is significantly reduced. Furthermore, I have performed a comparative single molecule study on the diffusion behavior of proteins in the ER and the plasma membrane. By using an ER-retained mutant of SERT for single molecule tracking experiments, I found distinct differences in protein dynamics of transporters in the ER and wild type SERT located at the plasma membrane. In the last project of this thesis, I used superresolution microscopy to determine the nanoscopic distribution of SERT complexes in the plasma membrane of fixed cell lines. SERT was found to reside in specific clusters that are separated by protein depleted regions. Furthermore, preliminary results obtained in primary rat neurons indicate a distinct clustering of endogenous SERT along the axon.
en
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Abweichender Titel laut Übersetzung der Verfasserin/des Verfassers
Zsfassung in dt. Sprache
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