Biocatalytic cascade reactions towards the production of valuable fine chemicals

Abstract

Die Natur nutzt seit Anbeginn der Evolution das Prinzip von miteinander verknüpften Reaktionen, sogenannte Kaskadenreaktionen. Diese metabolischen Netzwerke sichern die Aufrechterhaltung von Leben, Wachstum und Reproduktion. In einer lebenden Zelle laufen diese Kaskadenreaktionen quasi in einem Ein-Topf-System in wässrigem Milieu ab. Die Hauptakteure dieses hoch geregelten interaktiven Reaktionssystems sind Enzyme. Das Designprinzip der Natur als Vorbild wird in dieser Arbeit die Entwicklung von artifiziellen Kaskadenreaktionen, durch die Zusammenführung von in der Natur nicht verknüpften Enzymen, gezeigt. An einem simplifizierten Modelsystem werden die Parameter, die eine solche Kaskade beeinflussen, studiert. Durch den Einsatz des Prinzips der retrosynthetischen Zerlegung, ein in der Chemie oft angewandtes System zur intelligenten Syntheseplanung, wurde eine Modellkaskade entworfen. Auch in der Biokatalyse kann dieses System, bei dem ein hochwertiges Produkt auf simple Ausgangsmaterialen zurückgeführt wird, Anwendung finden. Die einzelnen Transformationen von funktionellen Gruppen werden in diesem Falle von Enzymen katalysiert. Im ersten Schritt der studierten Kaskade sollte ein nicht aktiviertes cyclisches Alken durch die Addition von Sauerstoff in einer Hydroxylierung für weitere Modifikationen aktiviert werden. Der entstehende ungesättigte allylische Alkohol wird im zweiten Schritt durch Oxidation in ein ungesättigtes Keton überführt. Durch eine anschließende Reduktion entsteht ein gesättigtes cyclisches Keton, das im letzten Schritt mittels Baeyer-Villiger Oxidation zu einem Lakton funktionalisiert wird. All diese Schritte der Kaskadenreaktion können effizient und selektiv von Enzymen katalysiert werden. Durch den Aufbau dieser Kaskade sollte ein tieferes Verständnis des Zusammenspiels von Redox-Enzymen ermöglicht werden. Da sich die initiale Hydroxylierung des cyclischen Alkens schwierig gestaltete wurde vorerst eine drei-stufige Kaskadenreaktion genauer charakterisiert. Dafür wurden eine Alkoholdehydrogenase, eine Enoatreduktase und eine Baeyer-Villliger Monooxygenase in den mikrobiellen Wirtsorganismus Escherichia coli eingebracht. Dieses artifizielle System wurde sowohl in vitro als auch in der Ganzzelle genau untersucht. Durch die Auswahl von geeigneten Ausgangsmaterialien wurde die Überlappung der Substratprofile der einzelnen Kaskadenenzyme erreicht und dadurch der Zugang zu verschiedenen optisch reinen Laktonen ermöglicht. Schließlich konnte die Hydroxylierung, der ersten Kaskadenschritt, im Wirtsorganismus Pseudomonas putida realisiert werden. Aus diesem Grund wurde ein Mischkultursystem zur Zugänglichmachung von cyclischen Alkenen als Startmaterialien getestet. Der Einsatz vom Naturstoff Limonen als Ausgangsmaterial ermöglichte so die Produktion von chiralen Carvolaktonen in einer vier-stufigen Kaskadenreaktion. In einem anwendungsorientieren Versuch wurde der Einsatz des Abfallprodukts Orangenschale als Ausgangsmaterial untersucht. Die Verfügbarkeit von Limonen aus der Orangenschale war hierbei ein wichtiger Faktor, der in unterschiedlichen Strategien behandelt wurde. Ein Ansatz war die in situ Extraktion von Limonen durch den Einsatz von ionischen Flüssigkeiten zu verbessern. Schlussendlich zeigte sich das in einem simplen wässrigen System durch die Kombination der beiden mikrobiellen Wirtsorganismen eine Kaskadenreaktion von Limonen aus Orangenschale zu Carvolakton, ohne Extraktionszusätze, erreicht werden konnte.

Nature uses the principles of interconnected reactions, so called cascade reactions, since the beginning of evolution. These metabolic networks ensure the perpetuation of life, growth and reproduction. In a living cell these cascade reactions are executed in a one-pot-system in aqueous environment. The main actors of this highly regulated interactive reaction system are enzymes. Taking natures design principle as model, in this work the establishment of artificial cascade reactions is shown by combining naturally not connected enzymes. Parameters influencing such a cascade are studied in a simplified model system. The model cascade was designed on the basis of the retrosynthetic approach, a regularly applied tool for intelligent synthesis planning in organic chemistry. This concept, where a desired valuable product is broken down to simple starting material, can also be employed in biocatalysis. Here the individual functional group interconversions are catalyzed by enzymes. In the first step of the studied cascade a cyclic alkene should be activated by introduction of oxygen in a hydroxylation reaction exploited for further modifications. The produced unsaturated allylic alcohol is oxidized to an unsaturated ketone in the second step. Subsequent reduction yields a saturated cyclic ketone, which is functionalized towards a lactone in the last step via a Baeyer-Villiger oxidation. All these steps of the cascade reaction can be efficiently and selectively catalyzed by enzymes. The composition of this cascade should enable to gain a deeper understanding of the interplay of different redox enzymes. As the initial hydroxylation of cyclic alkenes proved difficult, a three-step cascade was implemented and investigated beforehand. Therefore, an alcohol dehydrogenase, an enoate reductase and a Baeyer-Villiger monooxygenase were introduced into the microbial host Escherichia coli. This artificial system was thoroughly investigated in vitro and also in a whole-cell system. Through sensible choice of diverse starting material overlapping of the individual substrate scopes was accomplished which led to the production of enantiopure chiral lactones. Finally, the hydroxylation as the first step of the designed cascade could be realized in the microbial host organism Pseudomonas putida expressing the heterologous enzyme cumene dioxygenase. Therefore a mixed-culture system was tested for the implementation of cyclic alkenes as substrates. Through utilization of natural product limonene as starting material the production of chiral carvolactone could be achieved in a four-step cascade reaction. In an application oriented approach the utilization of waste product orange peel was investigated as starting material. Here, the availability of limonene from orange peel was a crucial parameter which was addressed with different concepts. One approach was the addition of ionic liquids to enhance the in situ extraction of limonene. Finally a cascade reaction from limonene from orange peel to carvolactone was achieved by combination of two microbial expression hosts in an aqueous system without the addition of extraction enhancers.