Synthesis of bioactive molecules for the investigation of ion channels and transporters

Abstract

Die vorliegende Arbeit umspannt drei Themengebiete; die Synthese von i) Piperin-derivaten und ii) Pyrazolochinolinonen als GABAA Rezeptormodulatoren und iii) die Synthese von Methcathinonen und verwandten Metaboliten für die Untersuchung von Monoamintransportern (MAT). i) -Aminobuttersäure Typ A (GABAA) Rezeptoren sind die wichtigsten inhibitorischen Neurotransmitterrezeptoren im Zentralnervensystem. Die Aktivierung dieses Rezeptortyps über den endogenen Liganden führt zu einem verstärkten Chloridionen-Strom durch die Zellmembran und damit zu Hyperpolarisation und Inhibition der Reizleitung. Wirkstoffe, die den Effekt des endogenen Liganden modulieren finden Verwendung in sedierenden, anxiolytischen und antikonvulsiv wirkenden Präparaten. Die nur begrenzte Adressierbarkeit einer dieser Wirkungen ist auf mangelnde Subtypen-Selektivität zurückzuführen, und führt zum Auftreten schwer-wiegender Nebenwirkungen. Die Entwicklung von selektiven Substanzen würde hier zu großen Verbesserungen führen. Der Naturstoff und TRPV1-Agonist Piperin, das scharfe Alkaloid des schwarzen Pfeffers, wurde unlängst als GABAA Rezeptormodulator identifiziert. Die Struktur des Piperins besteht aus einem Piperidinamid, einem konjugierten Dien und dem Benzodioxolring. Vorarbeiten der Gruppe von T. Erker haben gezeigt, dass die Aktivität durch Modifikation des Amid-Substitutionsmusters verbessert werden konnte. Basierend auf der Analyse biologischer Daten wurde eine Bibliothek von Derivaten mit versteifter Dienbrücke (z.B. Substitution des Diens mit aromatischen Ringen) hergestellt. Für die Synthese von Aryl-modifizierten Piperinderivaten wurde eine neuartige Heck-Kupplung von konjugierten Dienen mit Arylhalogeniden entwickelt. Über gezielte Modifikationen konnte die die Trennung von TRPV1- und GABAA-Aktivität, eine Erhöhung der Wirksamkeit und die Entdeckung von ß2-selektiven Derivaten (relevant für die Entwicklung von nicht-sedierenden angstlösenden Wirkstoffen) erreicht werden. ii) Als zweite Klasse von GABAA Liganden wurden Pyrazolochinolinone untersucht, deren Bindungsstelle an der -+ß- Grenzfläche kürzlich aufgeklärt werden konnte. Mit dem Ziel, wirkungsrelevante Strukturmerkmale zu identifizieren, wurde eine Bibliothek von Derivaten hergestellt. Dabei gelang es einerseits -- und -6-selektive Liganden zu entwickeln und in anderen Liganden die Affinität zur Benzodiazepin-Bindungsstelle zu unterdrücken. Weiters konnten zwei neue heterozyklische Grundgerüste als GABAA Liganden identifiziert werden. iii) Methcathinone sind als illegale Drogen weit verbreitet. Diese Inhibitoren der MAT werden überlicherweise als Racemate konsumiert. In dieser Arbeit wurden Proben einiger wichtiger Methcathinone als enantiomerenreine Verbindung hergestellt und pharmakologisch charakterisiert. Dabei zeigte sich eine signifikant höhere Potenz der untersuchten (S)-Methcathinone. Eines der häufigsten Methcathinon-derivate ist Mephedron. Trotz seiner kurzen Halbwertszeit im Blutplasma zeigt diese Verbindung langanhaltende Effekte im Menschen. Eine Reihe potenziell bioaktiver Metaboliten wurde in der Vergangenheit mittels Massenspektrometrie identifiziert und in dieser Arbeit in racemischer und enantiomerenreiner Form synthetisiert. Ihre pharmakologische Untersuchung zeigte, dass Nor-methylmephedron und 4'-Hydroxymephedron potente Inhibitoren der MAT sind oder deren Transportrichtung sogar umkehren können. Dabei erhöhen sie die Konzentration der Monoamin-Neurotransmitter im synaptischen Spalt noch weiter. Diese Resultate bestätigen klar die Existenz psychotroper Mephedronmetaboliten.

The present thesis has three major subjects, the synthesis of (i) piperine analogs and (ii) pyrazoloquinolinones as GABAA receptor modu-lators, and (iii) the synthesis of methcathinones and related metabolites for the investigation of monoamine transporters (MATs). (i) -Aminobutyric acid type A (GABAA) receptors are the major inhibitory neurotransmitter receptors in the central nervous system. Activation of GABAA receptors leads to opening of the chloride ion channel and ultimately to hyperpolarization of the neuron. Compounds enhancing the effect of the endogenous ligand GABA, many of which are currently in clinical use, possess sedative, anxiolytic or anticonvulsant effects. The insufficient separation of these properties, and thus the occurrance of severe side effects, is closely associated with a lack of receptor subtype selectivity of currently available drugs. In this context, patients would greatly benefit from the development of novel subtype selective ligands with improved side-effect profiles. The natural product piperine, the pungent alkaloid of black pepper, was recently identified as GABAA receptor modulator and TRPV1 agonist. The structure of piperine is comprised of a piperidine amide, a conjugated diene and the benzodioxole moiety. Preliminary work by the group of T. Erker established that both potency and efficacy could be improved by modification of the amide moiety. Based on a hypothesis generated through analysis of biological data available from synthetic analogs and related natural products, a library of derivatives with rigidified linkers (e.g. replacement of double bonds with aromatic rings) was synthesized. To facilitate the preparation of aryl-modified piperine analogs a novel Heck-coupling protocol of conjugated dienes was developed enabling the synthesis of target compounds in a single reactions step from commercially available starting materials. Eventually, a separation of GABAA and TRPV1 activity, an improvement of efficacy and the discovery of functionally selective compounds for ß2-containing receptors (relevant for non-sedative anxiolysis) has been achieved. ii) As a second class of GABAA ligands pyrazoloquinolinones were investigated. After the recent discovery of their binding site at the -+ß- interface a focused library of ligands was prepared to elucidate determinants for efficacy and potency. In this work, functionally selective ligands for -- and -6-containing receptors have been discovered which exert their effect at the -+ß- interface. Furthermore, ligands with suppressed affinity to the benzodiazepine binding site were designed and synthesized. In an effort to extend the scope of -+ß- ligands, two novel active scaffolds, imidazoquinolines and an indole-based structure, were discovered. iii) Methcathinones are widely used recreational drugs. These inhibitors of MATs are typically consumed as racemic mixtures. In this work, enantiomerically pure samples of representative methcathinone derivatives were prepared through asymmetric synthesis and pharamcologically characterized, revealing a significantly higher potency of the (S)-methcathinones. One of the most commonly used methcathinones is mephedrone. Despite its short half-life in blood plasma this compound has a long-lasting effect in humans. A range of potentially bioactive metabolites have previously been identified by mass-spectrometry. In this project, these metabolites were synthesized in their racemic and optically pure forms. An investigation into the pharmacology of these synthetic metabolites revealed that nor-methylmephedrone and 4'-hydroxymephedrone act as potent inhibitors of MATs or even reverse the direction of transport. Thereby they further increase the concentration of monoamine neurotransmitters in the synaptic cleft. Taken together, these results clearly confirmed the existence of psychoactive mephedrone metabolites.