Development of a sensor-integrated organ-on-chip platform for the investigation of size-dependent effects on neural differentiation of P19 embryoid bodies

Abstract

Neuronale Zellkulturen werden häufig als Forschungsmodelle für die Untersuchung der Entwicklung des Nervensystems oder für Neuropathien verwendet. Damit davon abgeleitete Erkenntnisse auf den Menschen angewandt und Therapien entwickeln werden können, ist eine möglichst realitätsnahe Zellkultur für die Validität dieser Modelle entscheidend. Organ-on-Chip (OOC) Systeme mit drei-dimensionalen Zellkulturtechniken gelten dabei als innovative Ansätze für solche Modelle.Diese Diplomarbeit behandelt die Planung, Herstellung, Charakterisierung und Erprobung einer mikrofluidischen Organ-on-a-Chip (OOC) - Plattform für die Untersuchung von größenbedingten Unterschieden in der neuronalen Differenzierung von muralen P19 Embryonalkarzinomzellen. Zellen dieser Linie durchlaufen bei Exposition mit Retinsäure eine dem Menschen auf zellulärer und signalmolekularer Ebene ähnliche embryogenetische Entwicklung, wenn sie in multizellulären Spheroiden, auch Embryoid Bodies genannt, angeordnet sind. Im Rahmen dieses Projekts wurde der Einfluss verschiedener Zellsaatdichten der Embryoid Bodies auf Wachstum, Größe, Morphologie, elektrischer Aktivität sowie Differenzierungseffizienz systematisch untersucht. Langfristig kann dieses Modell darüber hinaus zur Untersuchung des Nervensystems und der Erforschung neurologischer Krankheiten dienen. Es wurde ein Multielektrodenarray (MEA) zur Messung elektrophysiologischer Signale wie Aktionspotentiale integriert wurde, wobei drei verschiedene Herstellungsprozesse des MEAs erprobt wurden. Die Entwicklung dieses OOC in-vitro Modells ist motiviert durch Hindernisse in der aktuellen wissenschaftlichen Praxis aufgrund hoher Kosten, ethischer Bedenken oder schwacher Aussagekraft der Ergebnisse bisher existierender in-vitro Modelle.Das Multielektrodenarray wurde durch photolithographische erstellungsprozesse im Reinraum hergestellt und auf elektrischer Leitfähigkeit getestet. Es wurden Mikroelektroden mit verschieden dichen Ti/Au - Beschichtungen sowie einer optisch transparenten Ti/ITO/Au - Schicht aufgesputtert. Die elektrische Charakterisierung ergab beim Ti/Au-MEA mit erhöhter Metallschichtdicke die beste Leitfähigkeit. In der Folge wurde das mikrofluidische Zellreservoirsystem mit vier getrennten Saatkammern per 3D-Modellierung designed, flussmechanisch simuliert, aus PDMS hergestellt und auf dem MEA positioniert und gebondet. Zur Untersuchung der P19 Krebszelllinie wurden verschiedene Färbetechniken und optische Analysemethoden herangezogen sowie elektrophysiologische Messungen der differenzierten P19-Zellen auf dem MEA-PDMS-Chip durchgeführt. Die P19-Spheroide zeigten gute Viabilität, Differenzierungsfähigkeit und elektrische Aktivität und konnten erfolgreich am Chip überleben und Neuriten bilden. Bei den P19-Zellspheroiden wurde die Größenentwicklung in Abhängigkeit der Saatzelldichte sowie eine Obergrenze der Saatdichte von 5000 Zellen/Titer festgestellt, da darüber liegende Saatdichten zu hohem Auftreten von toten Zellbestandteilen sowie veränderter Morphologie der Spheroide führt. Weiterhin wurde ein Ansteigen der Differenzierungseffizienz mit höherer Saatzahl gefunden mit einem Maximum bei 1000 Zellen/Titer, weshalb diese Dichte für weitere Untersuchungen empfohlen wird. Außerdem wurde bei größeren Spheroiden die Varianz der Differenzierungsrate immer größer, sodass kleinere Spheroide reproduzierbarere Ergebnisse liefern, sodass unter Beachtung dieser Parameter eine optimale Validität erwartet werden kann. Die Messung der elektrischen Aktivität ergab keine nachweisbaren elektrischen Signale, wobei in einer Fehleranalyse mehrere potentielle Problemquellen identifiziert wurden. Anschließend wurde eine optimierte Designiteration des PDMS-Chips vorgestellt.Die im Rahmen dieses Projektes hergestellte mikrofluidische Organ-on-Chip-Plattform kann erfolgreich zur Zucht von P19 Embryoid Bodies und in zukünftigen Projekten zur Untersuchung größenabhängiger Unterschiede in der neuronalen Differenzierung eingesetzt werden. Langfristig kann diese Plattform als in-vitro Modell zur Erforschung des Nervensystems und neurologische Erkrankungen benutzt werden.

Neural cell cultures are commonly used as research models for the investigation of the development of thenervous system and neurological diseases. To ensure high validity of the results derived by such models, cell cultures need to be designed as realistic as possible. Organ-on-chip (OOC) systems with three-dimensional (3D) cell culture techniques are regarded as an innovative approach for such models.This master’s thesis deals with the planning, designing, producing and evaluation of a microfluidic organ-on chip platform with an integrated multielectrode array and the investigation of size-dependent influence on the differentiation of P19 embryonal carcinoma cell line, organised in a multicellular spheroid called embryoid body. In detail, the influence of the seeding density of P19 embryoid bodies on growth, size, morphology, electricalactivity and differentiation efficiency has been examined.This cell line shows embryogenetic and neurogenetic similarities in terms of molecular expression and signalling pathways and is ideal for modelling neurodevelopmental diseases when cultured as a multicellular spheroid in exposition to retinoic acid. The resulting in vitro research model can aid in the investigation of neurological diseases on a cellular and molecular level and can function as an alternative to animal models or other in vitro models, which suffer from rising costs, ethical concerns and low translatability of the results. The multielectrode array was produced with microfabrication technology using photolithographic thin film deposition processes in the cleanroom. Two thin film processes with titanium and gold (Ti/Au) as conduction layer with varying thickness and one optically transparent microelectrode array with titanium, indium tin oxide and gold (Ti/ITO/Au) thin film design were produced. In the following assessment of their electrical conductivity the Ti/Au-MEA with increased conduction layer thickness yielded the lowest resistivity. The microfluidic cell culturing chip with four seeding chambers was designed in 3D, fluid-mechanically characterised, produced with PDMS and bonded to the MEA. For the investigation of the P19 embryoid bodies various dyeing techniques and optical analysis methods have been used. Finally, an electrophysiological measurement of neurophysiological activity of the differentiated P19 embryoid bodies on the self-built MEA-PDMS-system has been executed.The P19 spheroids demonstrated high viability, differentiation capability towards neural tissue and calcium ion-channel activity, which points towards spontaneous action potential generation. The embryoid bodies yielded a positive correlation between size and initial seeding density with a reasonable cut-off density of 5000 cells per well. Above this seeding density morphological malformations and high amounts of floating cell debris occur. The P19 cell spheroids showed a significant correlation between high differentiation efficiency and high seeding density with increasing variance, so that smaller spheroids yield lower differentiation rates but higher reproducibility. Therefore, high validity of results can be expected under consideration of these parameters. The P19 embryoid bodies could successfully be seeded on the chip, where they proliferated and formed neural processes. Continuous fluid mechanical examination displayed neglectable fluid shear stresses. The electrophysiological measurements yielded inconclusive recordings. An error analysis revealed possible sites of optimisation, and a redesign with improved parameters of the PDMS chip is presented.The microfluidic organ-on-chip platform, which was designed and built in this thesis, can be used for growing P19 embryoid bodies and investigate size-dependent differences in the neural differentiation. It can serve as an in vitro model for future investigations around diseases of the central nervous system, like neurodevelopmentaldiseases.