Microdevices for molecular diagnostics : continuous flow PCR, nucleotide fluorescence labelling, DNA sensing and fluorescence enhancement

Abstract

Diese Dissertation befasst sich mit Mikrogeräten als fortgeschrittene molekular-diagnostische Tests. Das Ziel sind Geräte, die Untersuchungen schneller, einfacher und günstiger durchführen können als derzeitige Verfahren. Die molekulare Analyse von Lebensmittel- oder Umweltkontaminationen, Infektionserregern oder Krankheitsindikatoren kann durch solche Instrumente erheblich verbessert werden. Im Speziellen werden vier Mikrosysteme präsentiert: Durchfluss Polymerase-Kettenreaktion (PCR), Nukleotid-Fluoreszenzmarkierung, DNS-Messung und Fluoreszenzverstärkung.<br />Durchfluss-PCR wurde mit einem mikrofluidischen Ansatz realisiert, bei dem aufeinanderfolgende Probentröpfchen bearbeitet werden. Der verwendete Mikroschlauch wurde um drei Heizplatten mit konstanten Temperaturen gewickelt. Die drei Temperaturzonen repräsentieren die DNS-Denaturierung, die Primerhybridisierung und die Elongation, um ein vollständiges PCR Protokoll umzusetzen. PCR-Produktlängen von bis zu 1.3 kbp konnten amplifiziert werden und ein Probendurchsatz von bis zu 80 Proben pro Stunde wurde erreicht, was eine Verbesserung im Vergleich zu bisher publizierten Verfahren darstellt. Detektionslimits von bis zu 100 bakterielle Zellen pro Reaktion wurden erzielt.<br />Nukleotid-Fluoreszenzmarkierung wurde mit einem Einweg-Mikrofluidik-Chip aus Polycarbonat realisiert. Bakterielle DNS wird in einer einzelnen Reaktion amplifiziert und markiert, was zu einem hybridisierungsfertigen Gemisch führt, welches direkt für DNS-Mikroarrays eingesetzt werden kann. Der Polycarbonat-Chip besteht aus einem spiralförmigen Kanal, durch den die Proben gepumpt werden. Für die Herstellung wurde Spritzguss und thermisches Bonden eingesetzt, was den Chip für die Massenfertigung und den Einsatz als Einweg-Test qualifiziert. Im Vergleich zur Standardmethode, konnte eine Prozessbeschleunigung von 6 h auf 1.5 h erreicht werden mit Detektionslimits von bis zu 100 bakterielle Zellen pro Reaktion.<br />Für die Durchfluss-Detektion von PCR-Produkten wurde DNS mit einer fluoreszenzmessenden Mikrofluidik-Kammer erfasst. Sie besteht aus einer LED-Photodioden Einheit, die DNS-Proben im Durchfluss misst. Im Speziellen wurde sie für die Messung von nicht gereinigten PCR-Produkten, welche auch Primer und Polymerasen enthalten, entwickelt.<br />Dies wurde durch das Aufschmelzen von Primer-Dimeren mittels Temperierung der gesamten Kammer auf 60°C erreicht. Dieser Ansatz unterbindet Signale von Primer-Dimeren und ermöglicht hohe Sensitivitäten bei der Messung von PCR-Produkten. Mikrobielle DNS-Ausgangsmengen von 10 Zell-äquivalenten pro Reaktion vor der PCR konnten noch detektiert werden. Das Detektionslimit von gereinigten DNS-Proben betrug 1 ng/µL, bei einem Durchsatz von 240 Proben pro Stunde. Der Detektor kann direkt nach Durchfluss-PCR Systemen, wie beispielsweise das schlauchbasierte System oder der Polycarbonat-Fluoreszensmarkierungs-Chip, angschlossen werden.<br />Fluoreszenzverstärkung wurde mit Hilfe von Metall- und Metalloxid-Dünnschichten erzielt, welche mittels Kathodenzerstäubung, Tauch- und Rotationsbeschichtung hergestellt wurden. Durch den aufgebrachten Dünnfilm werden Anregungs- und Emissionslicht der Fluoreszenzmessung verstärkt und die Signalintensität erhöht. Die verschiedenen Schichten wurden mit DNS-Mikroarrays und bakteriellen Erregern als biologische Proben getestet. Gold-Beschichtungen erreichten eine 8-fache Signalsteigerung im Vergleich zu gewöhnlichen Glas-Objektträgern. Für diagnostische Anwendungen bedeutet das eine wesentliche Erhöhung der Sensitivität.<br />Die präsentierten Mikrosysteme und Dünnschichten sind derzeitigen Testverfahren überlegen. Es konnte gezeigt werden, dass sie das Potential haben molekular-diagnostische Untersuchungen hinsichtlich Kosteneffizienz, Prozessintegration, Probendurchsatz, Miniaturisierung, Sensitivität und Schnelligkeit zu verbessern. Dies führt wiederum zu einer überlegenen Analyse von Infektionserregern, Lebensmittel- und Umweltkontaminationen oder Krankheitsindikatoren.<br />

This dissertation addresses microdevices, designed as advanced molecular diagnostic assays. The aim is to make tests and devices faster, less complex and more cost-effective than current methods. The molecular analysis of food-contamination, environmental threats, infectious pathogens or disease biomarkers can be improved significantly by such instruments. In particular four microsystems are presented:<br />continuous-flow polymerase chain reaction (PCR), nucleotide fluorescence labelling, DNA sensing and fluorescence enhancement.<br />Continuous-flow PCR was realised with a microfluidic approach, processing consecutive sample droplets. The used micro-tubing was coiled around three heating plates with constant temperatures for denaturation, annealing and extension to implement a complete PCR protocol. Target lengths up to 1.3 kbp could be amplified and sample throughputs of up to 80 samples per hour could be realised, which is superior to other publications. Detection limits down to 100 bacterial cells per reaction were achieved.<br />Nucleotide fluorescence labelling was performed in a disposable microfluidic polycarbonate chip. Bacterial DNA is amplified and labelled in a single reaction, which results in a hybridisation-ready mix, ready for microarray analysis. The polycarbonate chip consists of a spiral channel, where the samples are pumped through. Injection moulding and thermal bonding was used for fabrication, which qualifies the device for large-scale production and for the application as single-use test. In comparison to the standard method an overall process acceleration from 6 h to 1.5 h could be achieved with sensitivities down to 100 bacterial cells per reaction.<br />For the detection of PCR products in continuous-flow, DNA sensing was realised with a fluorescence measuring microfluidic flow-cell. It comprises a LED-photodiode unit, sensing DNA samples in continuous flow.<br />In particular it was designed for measuring unpurified PCR products including primers and polymerases, which was achieved by heating the flow cell to 60°C. This approach suppresses signals from primer dimers and enables high sensitivities when detecting PCR products. Initial microbial DNA amounts before PCR of 10 cell equivalents per reaction were still detectable. The detection limit of purified DNA samples was 1 ng/µL at a throughput of 240 samples per hour. The detector can be directly connected to continuous-flow PCR devices like the tubing system or the polycarbonate fluorescence labelling chip.<br />Fluorescence enhancement was achieved with metal and metal oxide thin films fabricated by sputtering, dip- and spin-coating. Excitation and emission light from fluorescence sensing is amplified by the coatings and increases signal output. The different thin films were assessed by DNA microarrays with bacterial pathogens as biological samples. Gold coatings resulted in an 8-fold signal increase compared to bare glass slides. For diagnostic applications, this means a significant increase of sensitivity.<br />The presented microdevices and thin film coatings are superior to current assays. It could be shown, that they have the potential to improve molecular diagnostic methods in aspects of costs, process integration, sample throughput, miniaturisation, sensitivity and rapidness. In a further consequence, this leads to a superior analysis of pathogens, food- and environmental contaminations or disease biomarkers.