Micro- and nanostructured surfaces for studying T cell activation

Abstract

Die räumliche Anordnung funktionaler Komponenten ist eines der grundlegenden Konzepte auf zellulärer Ebene. Obwohl es eine Vielzahl von Methoden gibt, die räumliche Verteilung von Biomolekülen in Zellen abzubilden, sollte Observation durch Interaktion ergänzt werden, um biologische Systeme vollständig zu verstehen. Hier wurden unterschiedliche Mikro- und Nanostrukturierungstechniken eingesetzt, um verschiedene Aspekte der T-Zell-Aktivierung zu untersuchen. Die DNA-Origami-Technik ermöglicht es, Liganden präzise im Nanometerbereich zu positionieren. In dieser Arbeit wird eine DNA-Origami-Nanoplattform als Interaktionsplattform mit verschiedenen Funktionalitäten konzipiert, um den Einfluss unterschiedlicher räumlicher Anordnungen von Liganden auf die Aktivierung von T-Zellen zu untersuchen. Weiters wird durch die Bindung dieser Nanoplattformen zusammen mit kostimulatorischen Proteinen an ein Lipid-Doppelschicht eine mobile Interaktionsplattform gebildet, die einer antigenpräsentierenden Zelle ähnelt. Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) ist eine häufig verwendete Methode zur Erfassung kinetischer Parameter bei Proteininteraktionen in lebenden Zellen. Dennoch werden FRAP-Experimente oft durch unspezifische Beiträge bei der Regeneration des Fluoreszenzsignals behindert. Protein-Mikrostrukturierung ermöglicht die Eliminierung solcher unspezifischen Beiträge und vereinfacht die Analyse von FRAP-Daten erheblich. Dieser Ansatz wird am Beispiel der Interaktion zwischen dem T-Zell-Rezeptor und der Syk-Kinase ZAP70 demonstriert. Electron-beam-induced deposition (EBID) ermöglicht eine maßgeschneiderte Oberflächenstrukturierung mit einer Auflösung unter 10 nm. Durch den geringen Durchsatz begrenzt, ist die Produktion von großformatigen EBID-Strukturen in angemessener Zeit nicht möglich. Daher implementieren wir einen Pick-and-Place-Manipulationsansatz, bei dem eine einzelne Zelle an einem beschichteten AFM-Cantilever befestigt und auf dem strukturierten Bereich positioniert wird. Weiters wird erörtert, wie EBID-Strukturierung mit dem DNA-Origami-Ansatz kombiniert werden kann.

Spatial organization of functional components is one of the fundamental concepts at the cellular level. Although a vast number of methods exists to visualize the spatial organization of biomolecules in cells, observation should be augmented by interaction in order to fully understand biological systems. Here, several micro- and nanostructuring techniques were implemented in order to investigate different aspects of T cell activation on the respective length scales. The DNA origami technique offers the possibility to position ligands precisely at the nanometer scale. In this thesis, a DNA origami nanoplate is designed to serve as an interaction platform featuring multiple functionalities. These platforms can be used to probe the effect of different spatial arrangements of ligands on T cell activation. Further, by attaching the DNA origami nanoplates and co-stimulatory proteins to a lipid bilayer system, a mobile interaction platform is formed which closely resembles an antigen presenting cell. Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) is a commonly used technique to acquire kinetic parameters on protein interactions in living cells. Still, FRAP experiments are often hampered by non-specific contributions to the fluorescence recovery signal. Protein micropatterning, the second approach used in this thesis to achieve spatial organization, allows for the elimination of such non-specific contributions and considerably simplifies the analysis of FRAP data. This approach is demonstrated on the example of the interaction between the T cell receptor and the Syk kinase ZAP70. Electron-beam-induced deposition (EBID) allows for custom designed surface structuring with sub-10 nm resolution. Still, this method is limited by its low throughput and production of large scale EBID structures is not feasible in a reasonable amount of time. Here, we implement a pick-and-place manipulation approach in which a single cell is attached to a coated AFM cantilever and positioned on the structured area. Further, it is discussed how EBID structuring can be combined with the DNA origami approach.